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Una volta integrata con successo la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS o spettroscopia NIR) nel flusso di lavoro di analisi, il tuo laboratorio trarrà vantaggio da un metodo veloce, accurato e non distruttivo per le analisi di routine. Ma come dovresti procedere per implementare la spettroscopia NIR nel flusso di lavoro del tuo laboratorio?
In questa terza puntata della nostra serie sulla spettroscopia NIR, descriviamo i passaggi necessari per implementare un metodo NIR nel tuo laboratorio, presentati in un esempio reale.
Cominciamo facendo alcune ipotesi:
- La tua azienda produce materiale polimerico. Il laboratorio ha investito in un analizzatore NIR per misurazioni rapide dell'umidità (in alternativa alla titolazione Karl Fischer) e misurazioni rapide della viscosità intrinseca (in alternativa alle misurazioni con un viscosimetro).
- Il laboratorio ha appena ricevuto la nuova attrezzatura da laboratorio NIR,per esempio un NIRS DS2500 Analyzer.
Sia la determinazione dell'umidità che la misurazione della viscosità intrinseca sono esempi di analisi quantitativa. Nella maggior parte dei casi la spettroscopia NIR non può essere utilizzata immediatamente per questa analisi, poiché è necessario prima creare una calibrazione NIR (o un modello di previsione).
Come mostrato nella Figura 1, i passaggi per l'implementazione della spettroscopia NIR includono:
Step 1: Creare un set di calibrazione
Nella prima puntata di questa serie (Cos'è la spettroscopia NIR?), abbiamo già appreso che la spettroscopia NIR è un metodo secondario. Ciò significa che il vostro analizzatore NIR richiede un «addestramento» con una serie di spettri corrispondenti ai valori dei parametri provenienti da un metodo primario. Nel nostro esempio per l'analisi dell'umidità e della viscosità intrinseca, i metodi primari sono la titolazione Karl Fischer e la viscometria. In questo caso i valori delle analisi primarie sono noti.
Affinché il metodo sia robusto, i campioni nel set di addestramento, denominato set di calibrazione, devono coprire l'intero intervallo di concentrazione previsto dei parametri testati. Ciò riflette altre tecniche (ad esempio, cromatografia liquida ad alte prestazioni, HPLC) in cui la curva dello standard di calibrazione deve coprire l'intero intervallo di concentrazione previsto. Pertanto, se si prevede che il contenuto di umidità di una sostanza sia compreso tra 0,35% e 1,5%, anche i campioni nel set di calibrazione devono coprire questo intervallo.
Misura i campioni richiesti con l'analizzatore NIRS DS2500. Quindi, collegare i risultati delle misurazioni NIR ai valori ottenuti dai metodi primari (titolazione e viscometria Karl Fischer) sugli stessi campioni utilizzando un software. Ad esempio, inserisci semplicemente i valori di umidità e viscosità utilizzando iil pacchetto software Vision Air Complete (Figura 2). Successivamente, questi dati spettrali (il set di calibrazione) vengono utilizzati per lo sviluppo del modello di predizione.
Quanti campioni o spettri sono necessari?
Il numero ideale di spettri in un set di calibrazione dipende dalla variazione del campione (dimensione delle particelle, distribuzione chimica, ecc.). In questo esempio abbiamo utilizzato 10 campioni di polimeri, che rappresentano un buon punto di partenza per verificare la fattibilità di un'applicazione.
Tuttavia, per creare un set di calibrazione robusto che copra tutte le variazioni del campione e garantisca un'analisi quantitativa affidabile, sono necessari più spettri del campione. Di norma, nella maggior parte dei casi circa 40–50 spettri campione forniscono un modello di predizioneadeguato.
Il set di dati comprendente 40-50 spettri viene utilizzato anche per validare il modello di predizione. Ciò può essere fatto, ad esempio, utilizzando il pacchetto software Metrohm Vision Air Complete, che divide il set di dati in due gruppi di campioni:
- Set di calibrazione 75%
- Set di validazione 25%
Step 2: Creare e validare un modello predittivo
Creare un modello predittivo
Ora che il set di calibrazione è stato misurato nell'intervallo dei valori attesi, è necessario creare un modello di predizione. Questo passaggio è noto anche come sviluppo del modello di calibrazione NIR. Non preoccuparti: tutte le procedure sono completamente sviluppate e implementate nel pacchetto software Metrohm Vision Air Complete. Innanzitutto, ispeziona visivamente ciascuno spettro NIR per identificare le regioni che cambiano al variare della concentrazione. Spesso, l'applicazione di un pretrattamento matematico (come la derivata prima o seconda) migliora la visibilità delle differenze spettrali (Figura 3).
Una volta identificate visivamente, il software tenta di correlare queste regioni spettrali selezionate con i valori provenienti dal metodo primario. Il risultato è un diagramma di correlazione, comprendente le rispettive cifre di merito, ovvero l'errore standard di calibrazione (SEC, precisione) e il coefficiente di correlazione (R2). La Figura 4 mostra un esempio di diagramma di correlazione per l'umidità. La stessa procedura viene eseguita per gli altri parametri (in questo caso la viscosità intrinseca).
Analisi dei dati univariata e plurivariata
Il processo sopra descritto è ancora una volta simile alle procedure di lavoro generali con HPLC. Quando si crea una curva di calibrazione con HPLC, in genere l'altezza o l'intensità del picco (superficie) è collegata a una concentrazione di standard interno nota. Qui viene utilizzata solo una variabile (altezza o superficie del picco), quindi questa procedura è nota come «analisi dei dati univariata».
D'altra parte, la spettroscopia NIR è una tecnologia di «analisi dei dati multivariata». NIRS utilizza un intervallo dello spettro elettromagnetico (ad esempio, 1900–2000 nm per l'acqua) e pertanto vengono utilizzati più valori di assorbanza per creare la correlazione.
Validazione di un modello predittivo
Come in precedenza, un modello di predizione viene creato utilizzando il set di calibrazione, ma le predizioni verranno ora validate utilizzando il set di validazione. I risultati per questi campioni di polimeri sono mostrati sopra nella Figura 4. Gli utenti che non hanno esperienza con la creazione di modelli NIR e non si sentono ancora sicuri possono fare affidamento sul supporto Metrohm, noto per il suo servizio di alta qualità. Ti aiuteremo con la creazione e la validazione del modello di predizione.
Step 3: analisi di routine
La bellezza della spettroscopia nel vicino infrarosso viene messa a fuoco una volta creato e validato il modello di predizione. I campioni di polimeri con contenuto di umidità e viscosità intrinseca incogniti possono ora essere analizzati con la semplice pressione di un pulsante. L'analizzatore NIRS DS2500 visualizzerà i risultati per tali parametri in meno di un minuto.
Opzioni display
In genere vengono visualizzati solo i risultati. A volte i risultati sono evidenziati da un riquadro giallo o rosso per indicare un avviso o un errore, come mostrato nella Figura 5. Lo spettro stesso non viene mostrato.
Naturalmente esiste anche la possibilità di visualizzare gli spettri, ma per la maggior parte degli utenti (soprattutto per i lavoratori a turni) questi spettri non hanno significato e non possono ricavarne informazioni. In queste situazioni, solo i valori numerici sono importanti insieme a una chiara indicazione pass/fail.
Un'altra possibilità di visualizzazione è il grafico dell'andamento, che consente l'adeguamento proattivo dei processi produttivi. Anche qui vengono evidenziati i limiti di avvertenza e di azione (Figura 6).
Conclusioni
La maggior parte dello sforzo necessario per implementare la NIRS in laboratorio risiede all'inizio del flusso di lavoro, durante la raccolta e la misurazione dei campioni che coprono l'intero intervallo di concentrazione. La creazione e la validazione del modello di predizione, nonché l'implementazione nell'analisi di routine, vengono eseguite con l'aiuto del pacchetto software Metrohm Vision Air Complete e possono essere completate in un breve periodo. Inoltre, i nostri specialisti Metrohm NIRS ti supporteranno volentieri con la creazione del modello di predizione se hai bisogno di assistenza.
A questo punto, si noti che ci sono casi in cui la spettroscopia NIR può essere implementata direttamente senza alcuno sviluppo di modelli di predizione, utilizzando le pre-calibrazioni Metrohm. Si tratta di procedure operative robuste e pronte all'uso per determinate applicazioni (per es., viscosità del PET) basato sugli spettri del prodotto reale.
Presentiamo e discutiamo delle loro caratteristiche e vantaggi nel prossimo articolo:
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