Sdílet článek
Toto je třetí a poslední příspěvek v naší sérii, který vám poskytuje tipy a triky pro správné používání kolon pro iontovou chromatografii. V první část jsme většinou diskutovali standardní provozní podmínky i provozní limity pro kolony, zatímco v ve druhém příspěvku jsme se zaměřili na témata související s aplikací a na to, jaké parametry eluce lze změnit, aby se změnil výkon separace. V závěru této série se blíže podíváme na způsoby hodnocení výkonu kolony během její životnosti a nabídneme několik tipů pro odstraňování problémů, které mohou pomoci při řešení problémů, které se mohou objevit.
Kliknutím na téma níže přejdete přímo do každé sekce:
Základní parametry sloupce
Začněme tím, že se podíváme na hlavní parametry, které lze použít k posouzení výkonu sloupce. Většinu těchto referenčních hodnot lze získat z osvědčení o analýze. Certifikáty separační kolony lze nalézt v Metrohm Certificate Finder. Pravidelné reprodukování chromatogramu certifikátu za účelem ověření výkonu kolony může být užitečné pro detekci změn výkonu brzy a do zabránit nevratnému poškození sloupce.
Níže budeme zvažovat nejdůležitější parametry jeden po druhém.
Doba zdržení a kapacita kolony
Retenční čas jednotlivých analytů je dobrým měřítkem selektivity a kapacity kolony. Pokud retenční časy analytů neodpovídají retenčním časům certifikátu, existuje mnoho možných důvodů pro toto chování.
Možná, složení eluentu je špatnénapř. protože složky eluentu nejsou přítomny ve správných koncentracích. V případě, že je síla eluentu příliš vysoká, retenční časy se zkrátí. Tento jev se obvykle vyskytuje pro všechny ionty současně a posouvá všechny píky blíže k sobě. Tím jsou vícemocné ionty urychleny v silnější míře než jednomocné ionty. Tento problém lze vyřešit přípravou čerstvého eluentu se správným složením.
The eluent nemusí být čerstvý nebo není dostatečně chráněn z okolní atmosféry, např. s CO2 adsorbér. Oxid uhličitý z okolního vzduchu může v průběhu času měnit složení eluentu (tj. sílu, pH atd.), což ovlivní retenční časy analytů. Tento problém se týká zejména slabých hydroxidových eluentů, protože eluční síla uhličitanových iontů je mnohem silnější než hydroxidových iontů, což vede k silným posunům v retenčních časech. Proto jsou vícemocné ionty tímto ovlivněny více než monovalentní. Tento problém lze vyřešit přípravou čerstvého eluentu a použitím CO2 adsorbér. Při práci s hydroxidovými eluenty je také důležité ověřit stav zásobního roztoku hydroxidu, protože může absorbovat CO2 ze vzduchu. Obrázek 1 ukazuje účinek CO2 příjem ze vzduchu na retenční časy běžných aniontů.
Některé vzorky mohou obsahovat složky, které obsazují iontoměničové skupiny materiálu kolony. V takovém případě je počet dostupných iontoměničových skupin na koloně snížen ve srovnání s výchozím stavem, což vede ke zjevně menší kapacitě kolony a kratším retenčním časům. V závislosti na typu kontaminantů existují možnosti, jak tento efekt zvrátit a smýt je z povrchu kolony. Tyto regenerační postupy jsou individuálně přizpůsobeny různým stacionárním fázím a by měl být použit jako poslední možnost pro uložení sloupce.
Postupy i provozní limity jsou popsány v příslušných letácích rubriky a lze je nalézt na našem webu. Před provedením regenerační procedury se prosím poraďte se svým prodejcem Metrohm.
- V případě, že jde o kontaminaci z vícemocných iontů, je obvykle možné je smýt propláchnutím kolony eluentem o vyšší koncentraci. Přitom nezapomeňte na provozní limity kolony, zejména pokud jde o pH eluentu.
- Někdy se organické molekuly mohou adsorbovat na stacionární fázi kolony kvůli své silné afinitě k ní. To může vést k zablokování iontoměničových skupin a zkrácení retenčních časů spolu se zvýšeným provozním tlakem. Když k tomu dojde, může pomoci promytí stacionární fáze eluentem obsahujícím frakci organického modifikátoru. To zvýší afinitu kontaminantu k mobilní fázi a pomůže ji oddělit od stacionární fáze.
Obvykle lze po takovém regeneračním postupu obnovit původní kapacitu kolony.
Ještě lepší způsob, jak prodloužit životnost separační kolony, je pomocí pravidelně vyměňovat strážní kolonu. Jedním z jejích účelů je chránit separační kolonu před nečistotami tím, že je zadrží.
Zajistěte výměnu ochranné kolony třikrát až čtyřikrát za dobu životnosti separační kolony nebo ještě častěji, pokud se jedná o velmi složité matrice vzorků, jako jsou barviva nebo potravinové matrice. V těchto situacích doporučujeme použít Metrosep RP 2 Guard/3.5.
Chromatogram se překrývá Obrázek 2 ukazuje vliv defektního ochranného sloupce na tvar píku.
V některých případech je kapacita kolony snížena v důsledku chemické modifikace stacionární fáze. K tomu dochází, když je kolona používána v podmínkách mimo provozní limity – např. extrémní situace pH. Extrémní podmínky pH mohou změnit chemické vazby iontoměničových skupin na substrát základních částic. Tento nevratný proces vede k trvalá ztráta kapacity kolony. V tomto případě žádná regenerační procedura nemůže obnovit původní kapacitu kolony.
Vezměte prosím na vědomí, že k této ztrátě iontoměničových skupin dochází také pomalu během pravidelného používání iontoměničových kolon. Síla chemické vazby iontoměničových skupin je důkladně testována během vývoje kolon Metrohm, aby byla zajištěna dlouhá životnost kolony.
Teoretické desky a vrcholová symetrie
Počet teoretických pater (TP) může být užitečným nástrojem pro posouzení stavu naplnění kolony. Čím vyšší je hodnota TP, tím lepší je náplň kolony. Pro smysluplné posouzení náplně kolony zvolte analyt, který neeluuje příliš brzy na chromatogramu (tyto píky mohou být ovlivněny mimokolonovými efekty, zejména na 2mm systémech) a který není ovlivněn sekundárními interakcemi ( tj. nepoužívejte dusičnany). Pro kationty, draslík je dobrou volbou, zatímco pro anionty, síran je vhodnou volbou.
Přestože jsou kolony plněny při tlacích vyšších, než je normální provozní tlak, náplňové lože pokračuje v dalším zahušťování po celou dobu životnosti kolony s kontinuální aplikací proudící mobilní fáze (eluentu). Zatímco náplňové lože stacionární fáze se díky tomuto efektu zlepšuje, může to také vést k určitému mrtvému objemu na vstupu do separační kolony. Tento mrtvý objem může být zodpovědný za rozšíření píku a snížení teoretických pater, zejména na začátku chromatogramu.
I když se jedná o pravidelný proces stárnutí kolony, je možné jej zpomalit správnou péčí o kolonu. Preventivní opatření zahrnují pomalou iniciaci průtoku a teploty eluentu při spuštění, stejně jako správné a úplné vypnutí vysokotlakého čerpadla před odstraněním kolony, protože mechanické namáhání může být škodlivé pro náplňové lože. Výměna ochranného sloupku může mít často pozitivní dopad na teoretické desky a tvary píku (viz Obrázek 2).
Problémy s náplní kolony se často projevují také v hodnotách faktoru asymetrie a celkových tvarech píků. Výraznější fronting jakož i rozšíření vrcholu mohou být varovné signály pro směřování do kolony nebo strážní kolony. Bohužel tento druh poškození kolony je nevratný a vyžaduje výměnu separační kolony.
Před výměnou kolony je důležité zkontrolovat, zda problémy nepocházejí z kolony nebo jiného spojení v IC systému, kdykoli je na chromatogramu pozorováno rozšíření píku. Ujistěte se, že všechny kapiláry ve vysokotlaké dráze mají průměr ≤0,25 mm a že všechny kapiláry byly správně nainstalovány a připojeny bez dalšího mrtvého objemu. Systémy vybavené kolonami s malým vnitřním průměrem (2 mm, microbore) jsou silněji ovlivněny mrtvým objemem než systémy s kolonami o průměru 4 mm. To znamená, že při použití kolon microbore je zapotřebí menší mrtvý objem, aby se efekt rozšíření píku stal viditelným, ve srovnání s použitím kolon o průměru 4 mm.
Tlak ve sloupci
Dalším důležitým parametrem, který je třeba pravidelně kontrolovat po celou dobu životnosti kolony, je tlak v systému. Vysoký tlak je jedním z nejčastějších důvodů vedoucích k výměně kolony. Kdykoli zaznamenáte zvýšení tlaku, je důležité ověřit, která část systému IC je příčinou.
Pokud vzorek obsahuje částice a je aplikována nedostatečná příprava vzorku, částice se budou hromadit na vstupu do ochranného ochranného sloupku a případně vést ke zvýšení tlaku v systému. V tomto případě ochranná kolona plní zamýšlené použití k ochraně separační kolony a je třeba ji vyměnit. Pokud není ochranná kolona vyměněna dostatečně brzy, může dojít k proražení částicové kontaminace a nanesení na separační kolonu. Zatímco u ochranné kolony naplněné částicemi neexistuje žádný regenerační postup, separační kolony kontaminované částicemi lze regenerovat proplachováním kolony při nízkých průtokových rychlostech v opačném směru toku.
Upozorňujeme, že tyto regenerační postupy nemusí být vždy úspěšné.
Zabránění vstřikování částic do vysokotlaké dráhy IC systému je dobrý způsob ochrany ochranné a separační kolony. Metrohm poskytuje několik automatizovaných technik přípravy vzorků což má pozitivní dopad na životnost kolony. Nejběžnějšími technikami pro tento účel jsou Inline ultrafiltrace (Obrázek 3) a Inline dialýza.
Další informace o Metrohm Inline Ultrafiltration najdete v našem souvisejícím blogovém příspěvku.
Kdy musím vyměnit filtrační membránu za Inline Ultrafiltration?
Konec životnosti sloupce
Pro posouzení výkonu kolony (a systému IC) je třeba vzít v úvahu všechny parametry popsané výše. Mnohé z těchto parametrů je možné pečlivě sledovat v Software MagIC Net aby mohl být potenciální problém odhalen co nejdříve.
Přestože jsou kolony Metrohm IC navrženy a vyrobeny tak, aby měly velmi dlouhou životnost, v určitém okamžiku se výkon sníží a dokonce ani regenerační procedury nemusí být schopny obnovit požadovaný výkon kolony pro vyřešení potřeb aplikace. To představuje konec životnosti kolony a výměna separační kolony je nevyhnutelná.
Metrohm separační kolony nelze recyklovat a lze je likvidovat s běžným odpadem. V závislosti na měřených vzorcích a také na použitých typech chemikálií a souvisejících nebezpečích však může být nutné zvážit správnou možnost likvidace.
Bez ohledu na povahu vzorku, neotevírejte sloupek kdykoliv.
Přehled odstraňování problémů
stůl 1 poskytuje přehled o určitých strategiích odstraňování problémů při pohledu na chování vašeho sloupce.
Stůl 1. Prevence a náprava ztráty výkonu v IC kolonách
| Indikátor | Způsobit | Preventivní a nápravná opatření |
|---|---|---|
| Zvyšování protitlaku | Částice na ochranném sloupku | Vyměňte ochranný sloupek. |
| Částice na separační koloně | Propláchněte separační kolonu v opačném směru proudění
|
|
| Částice ve vzorku | Příprava vzorku, např. odstranění částic pomocí lnline ultrafltrace | |
| Zkrácená doba uchování | Uhličitan v eluentu | Oxid uhličitý ze vzduchu ovlivňuje rovnováhu uhličitan/hydrogenuhličitan v eluentu. Uhličitano/hydrogenuhličitanové eluční činidlo v průběhu času slábne; hydroxidový eluent posiluje.
|
| Vzduchové bubliny v eluentu | Vzduchové bubliny způsobují nestabilitu toku eluentu. Protitlak je indikátorem nestabilního průtoku. Mělo by to zůstat stabilní v rozsahu ± 0,1 MPa.
|
|
| Ztráta kapacity v koloně v důsledku vysokomocných iontů | Regenerujte kolonu podle letáku ke koloně, abyste odstranili všechny anorganické usazeniny. | |
| Ztráta rozlišení | Eluent je příliš starý nebo vyrobený nesprávně | Eluenty by měly být čerstvě připravené. Ujistěte se, že jsou vyrobeny správně a zejména, aby nedošlo k záměně uhličitanu a hydrogenuhličitanu. |
| Adsorpční účinek kontaminace usazené v ochranné koloně | Vyměňte ochranný sloupek. | |
| Adsorpční účinek kontaminace usazené v separační koloně | Regenerujte kolonu podle letáku ke koloně, abyste odstranili veškeré organické nebo anorganické usazeniny. | |
| Ztráta teoretických desek | Ochranný sloupek kontaminován | Vyměňte ochranný sloupek. |
| Kontaminovaná separační kolona | Regenerujte kolonu podle letáku ke koloně, abyste odstranili veškeré organické nebo anorganické usazeniny. | |
| Separační kolona přetížena | Separační kolona může být přetížena faktory, jako je vysoký obsah soli v matrici vzorku.
|
|
| Mrtvý objem v IC systému |
|
|
| Asymetrie | Mrtvý objem nebo kontaminace na ochranném sloupku | Vyměňte ochranný sloupek. |
| Kontaminovaná separační kolona | Regenerujte kolonu podle letáku ke koloně, abyste odstranili veškeré organické nebo anorganické usazeniny. |
Závěr
Tento článek vysvětluje, jak lze hodnotit a monitorovat výkonnost kolony IC po celou dobu životnosti kolony a jaká opatření lze přijmout k zajištění dlouhé životnosti kolony. Tím nyní uzavíráme sérii «Osvědčené postupy pro separační kolony v iontové chromatografii». Máte-li další dotazy, neváhejte kontaktovat místního prodejce IC Metrohm.
