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Im zweiten Teil dieser Blogserie über bewährte Verfahren für IC-Trennsäulen liegt der Fokus auf anwendungsbezogene Themen, die die Eignung und Stabilität der Säule beeinflussen. Zunächst geht es um die Wahl einer geeigneten Säule für die jeweilige Applikation. Dann betrachten wir die Betriebsparameter, die angepasst werden können, um die Trennung der Analyten zu optimieren, sowie die jeweiligen Auswirkungen und Möglichkeiten.
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Auswahl der Säulenlänge und des Säulendurchmessers
Metrohm bietet ein breites Spektrum an IC-Säulen, die unterschiedliche stationäre Phasen enthalten und unterschiedliche Längen und/oder Innendurchmesser haben. Die Wahl der stationären Phase hat großen Einfluss auf einerseits die Selektivität zwischen den einzelnen Analyten und andererseits die Stabilität gegenüber unterschiedlichen Probenmatrizes. Die Säulenlänge hat keinen Einfluss auf die Selektivität, sondern auf die Trennleistung zwischen den einzelnen Peaks.
Erfahren Sie mehr über Metrohms breites Angebot an Trennsäulen für die Ionenchromatographie in unserem Säulenkatalog.
Auswirkungen der Säulenlänge
In den folgenden Chromatogrammen (Abbildung 1) ist der Einfluss der Säulenlänge auf die Trenneffizienz für die Säulenserie Säulenserie Metrosep A Supp 17 Säulenserie dargestellt. Bei der Wahl der Säulenlänge sollten Sie die Komplexität der beabsichtigten Trennung und das Vorhandensein von Matrixkomponenten, die die Zielionen stören könnten, berücksichtigen.
Auswirkungen des Säulendurchmessers
Metrohm bietet nicht nur IC-Trennsäulen in verschiedenen Längen an, sondern auch die meisten Säulen sowohl mit 4 mm Innendurchmesser als auch mit 2 mm Innendurchmesser (sog. „Microbore“). Dabei gibt es mehrere Kriterien zu unterscheiden:
- Wenn Sie Online-Systeme im kontinuierlichen Modus einsetzen (d.h. Systeme, die mehrere Tage hintereinander unbeaufsichtigt laufen, wie z.B. das Metrohm-Prozessanalytiksystem MARGA – "Monitor for AeRosols and Gases in Ambient air"), empfehlen wir die Verwendung von 2 mm IC-Säulen. Aufgrund der geringeren Flussrate für Microbore-Säulen (nur 25% der Flussrate für 4 mm-Säulen) halten der Eluent und die Regenerierlösungen viel länger, was die Zeit verlängert, in der das Gerät unbeaufsichtigt gelassen werden kann.
- Es gibt Applikationen, die für eine höhere Selektivität und Empfindlichkeit der Analyten Kopplungstechniken wie IC-MS erfordern. In diesem Fall ist die Verwendung von 2-mm-Säulen ideal. Die niedrige Flussrate ist optimal für das Elektrospray-Verfahren, so dass vor dem Eintritt in das Massenspektrometer kein Flow Splitter erforderlich ist.
- In manchen Fällen ist nur eine begrenzte Probenmenge für die Injektion verfügbar. In solchen Situationen werden 2 mm-Säulen bevorzugt, da während des Trennungsprozesses weniger Verdünnung/Diffusion auftritt, was zu höheren Signalen führt.
- Enthält Ihre Probe hingegen eine hohe Menge an Matrixbestandteilen, so ist die Wahl einer geeigneten 4-mm-IC-Säule die bessere, da sie eine höhere Kapazität zur Abtrennung der gewünschten Analyten von der Matrix bietet.
Erfahren Sie in unserem Blogbeitrag mehr über MARGA und seine Möglichkeiten der kontinuierlichen Überwachung der Luftqualität.
Optimierung der Analyttrennung
Neben der Säule selbst können verschiedene andere Parameter verändert werden, um die Selektivität der Trennung zu optimieren. Zu diesen Parametern gehören die Temperatur, die Komponenten und die Stärke des Elutionsmittels sowie der Einsatz von organischen Modifiern.
Auswirkungen von Temperaturveränderung
Eine der einfachsten Möglichkeiten zur Feinabstimmung der Trennselektivität bei der IC ist die Änderung der Analysetemperatur. Dazu wird der im Gerät integrierte Säulenofen verwendet (sofern vorhanden). Es können mehrere Effekte beobachtet werden, zum Beispiel bei der Anionenanalyse. Ein Beispiel für den Einfluss der Temperatur auf die Selektivität ist im Chromatogramm-Overlay (Abbildung 2) für die Metrosep A Supp 17 Säulen dargestellt.
- Die einwertigen Ionen wie Fluorid, Chlorid, Nitrit, Bromid und Nitrat werden alle mit steigender Temperatur beschleunigt, was darauf hindeutet, dass weniger Wechselwirkungen mit der stationären Phase stattfinden.
- Das Verhalten von mehrwertigen Ionen wie Phosphat oder Sulfat ist komplizierter zu beschreiben und variiert je nach stationärer Phase. Im Allgemeinen werden mehrwertige Ionen bei höheren Temperaturen stärker verzögert, was zu einer Verlängerung der Retentionszeiten führt, wie bei Sulfat zu sehen ist. Phosphat hingegen verhält sich anders, da sich der pH-Wert des Eluenten temperaturbedingt in einem Bereich nahe dem pKa-Wert von Phosphat ändert. Aufgrund dieser pH-Änderung ändert sich auch die effektive Ladung des Phosphat-Ions (in diesem Beispiel wird die effektive Ladung mit steigender Temperatur verringert).
- Die Peakform der polarisierbaren Ionen, wie Nitrit, Bromid und insbesondere Nitrat, wird bei höheren Temperaturen deutlich verbessert. Der Grund für dieses Verhalten liegt in der Verringerung der sekundären Wechselwirkungen mit der stationären Phase.
Auswirkungen der Änderung der Zusammensetzung und Stärke des Elutionsmittels
Die Zusammensetzung und Stärke des Eluenten können angepasst werden, um die Elutionsreihenfolge verschiedener Analyten zu ändern, während dieselbe Trennsäule verwendet wird. In der Kationenchromatographie entwickelten P.R. Haddad und P.E. Jackson ein Retentionsmodell, das es Forschern ermöglicht, die Retentionszeiten bei geänderter Eluentzusammensetzung vorherzusagen [1].
In Anbetracht der Tatsache, dass die Säule bei jeder Bestimmung identisch bleibt, ist keine Änderung des Ionenaustauschgleichgewichts und der Säulenkapazität zu erwarten. Wenn nur die Eluentenkonzentration geändert wird, kann daher die folgende Korrelation verwendet werden:
Dabei gilt:
- k' ist der Retentionsfaktor des betreffenden Analyten
- c ist eine Konstante
- x ist die Ladung des Analyten
- y ist die Ladung des Eluenten
- Ey+M ist die Konzentration des Eluenten in der mobilen Phase
Wenn Salpetersäure als Eluent verwendet wird, ist y = 1 und das Modell kann wie folgt vereinfacht werden:
Wendet man diese Formel auf praktische Situationen im Labor an, so bedeutet dies Folgendes: Mit zunehmender Stärke des Eluenten werden die Erdalkalimetalle im Vergleich zu den Alkalimetallen (x = 2) viel schneller beschleunigt (x = 1), so dass es möglich ist, Magnesium vor Kalium zu eluieren. Dieser Effekt wird als Elektroselektivität bezeichnet.
Mehrwertige Metallionen sind in der Lage, mit speziellen Komplexbildnern Komplexe zu bilden. Daher können die Selektivitäten durch Zugabe von Komplexbildnern zum Elutionsmittel verändert werden. So wird beispielsweise Dipicolinsäure (DPA) häufig zur Komplexierung von Calcium verwendet, was zu einer Verringerung der effektiven Ladung von Calcium führt. Infolgedessen wird die Retentionszeit von Calcium verkürzt und Calcium eluiert im Chromatogramm vor Magnesium (Abbildung 3).
Die Retention von einwertigen Kationen kann durch den Zusatz von Kronenether zur mobilen Phase beeinflusst werden.
Anionensysteme sind hinsichtlich des Retentionszeitmodells komplexer, obwohl derselbe Elektroselektivitätseffekt bis zu einem gewissen Grad für Anionen beobachtet werden kann. Bei einer Änderung der Eluentenstärke ändert sich jedoch häufig auch der pH-Wert des Eluenten, was zu unterschiedlichen Deprotonierungsgleichgewichten von mehrwertigen Anionen (z. B. Phosphat) führt. Dies beeinflusst die effektive Ladung des Analyten und damit auch seine Retention in ähnlicher Weise, wie zuvor für die Auswirkungen von Temperaturänderungen beschrieben.
In einigen Fällen kann die Verwendung einer geringen Menge eines organischen Modifiers wie Methanol, Acetonitril oder Aceton im Elutionsmittel sinnvoll sein:
- Wenn eine bakterielle Kontamination bereits ein Problem war, kann die Zugabe von 5 % Methanol zum Elutionsmittel dazu beitragen, zukünftiges Bakterienwachstum zu verhindern.
- Wenn Proben, die viele organische Lösungsmittel enthalten, injiziert werden müssen und keine Probenvorbereitung wie Extraktion oder Matrixeliminierung (MiPCT-ME) möglich ist, wird empfohlen, dem Elutionsmittel einen geeigneten organischen Modifier zuzusetzen, um sicherzustellen, dass die organischen Lösungsmittel ordnungsgemäß aus der chromatographischen Säule gespült werden können.
Metrohm Inline-Probenvorbereitung (MISP)
- Bei der Verwendung von IC-MS wird außerdem empfohlen, dem Elutionsmittel einen organischen Modifier hinzuzufügen, um das Elektrospray-Verfahren zu verbessern.
Beachten Sie, dass die Zugabe organischer Modifier auch die Trennselektivitäten beeinflusst. Bei den Standardanionen ist der Effekt ähnlich dem, der bei erhöhten Temperaturen beobachtet wird: Die Peakformen der polarisierbaren Ionen wie Nitrit, Bromid und Nitrat verbessern sich.
Organische Säuren können im Vergleich zu den Standardanionen hingegen ganz anders reagieren und ihre Reaktion hängt auch stark von der Art des verwendeten organischen Modifiers ab. Beispielchromatogramme, die die Wirkung des organischen Modifiers auf die Retention von Analyten zeigen, finden Sie im Handbuch für die Metrosep A Supp 10 Säule.
Laden Sie das Säulenhandbuch der Metrosep A Supp 10 herunter, um Beispielchromatogramme zu finden, die die Auswirkungen organischer Modifier auf die Retentionszeit der Analyten veranschaulichen.
Referenz
[1] Haddad, P. R.; Jackson, P. E. Ion Chromatography: Principles and Applications; Journal of chromatography library; Elsevier; Distributors for the U.S. and Canada, Elsevier Science Pub. Co: Amsterdam, Netherlands; New York: New York, NY, USA, 1990
