Dies ist der dritte und letzte Beitrag unserer Serie mit Tipps und Tricks zur richtigen Verwendung von Ionenchromatographiesäulen. Im ersten Teil haben wir vor allem die Standardbetriebsbedingungen sowie die Betriebsgrenzen für Säulen besprochen, während wir uns im zweiten Beitrag auf anwendungsbezogene Themen und darauf konzentriert haben, welche Elutionsparameter geändert werden können, um die Trennleistung zu verändern. Im letzten Teil dieser Serie werden wir die Möglichkeiten zur Bewertung der Säulenleistung während ihrer Lebensdauer näher beleuchten und einige Tipps zur Fehlersuche geben, die bei der Behebung eventuell auftretender Probleme helfen können.

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• Wesentliche Säulenparameter
• Retentionszeit und Säulenkapazität
• Theoretische Böden und Peaksymmetrie
• Säulendruck
• Ende der Lebensdauer der Säule
• Übersicht zur Fehlerbehebung

Wesentliche Säulenparameter

Betrachten wir zunächst die wichtigsten Parameter, die zur Beurteilung der Leistung der Säule herangezogen werden können. Die meisten dieser Referenzwerte können aus dem Analysenzertifikat entnommen werden. Die Trennsäulenzertifikate finden Sie im Metrohm Zertifikatsfinder. Das regelmäßige Nachstellen des Zertifikatschromatogramms zur Überprüfung der Säulenleistung kann hilfreich sein, um Leistungsänderungen frühzeitig zu erkennen und irreversible Schäden an der Säule zu vermeiden.

Metrohm Zertifikatsfinder

Im Folgenden werden wir die wichtigsten Parameter einzeln betrachten.

Retentionszeit und Säulenkapazität

Die Retentionszeit der einzelnen Analyten ist ein gutes Maß für die Selektivität und Kapazität der Säule. Wenn die Retentionszeiten der Analyten nicht mit den Retentionszeiten des Zertifikats übereinstimmen, gibt es viele mögliche Gründe für dieses Verhalten.

Möglicherweise ist die Eluentenzusammensetzung falsch, z. B. weil die Eluentenkomponenten nicht in den richtigen Konzentrationen vorliegen. Wenn die Eluentenstärke zu hoch ist, werden die Retentionszeiten reduziert. Dieses Phänomen tritt in der Regel für alle Ionen auf und verschiebt alle Peaks näher zueinander. Dabei werden die multivalenten Ionen stärker beschleunigt als die monovalenten Ionen. Dieses Problem kann durch die Herstellung eines frischen Eluenten mit der richtigen Zusammensetzung behoben werden.

Möglicherweise ist das Elutionsmittel nicht frisch oder nicht ausreichend vor der Umgebungsatmosphäre geschützt, z. B. durch einen CO2-Adsorber. Kohlendioxid aus der Umgebungsluft kann die Eluentenzusammensetzung (d. h. Stärke, pH-Wert usw.) mit der Zeit verändern, was sich auf die Retentionszeiten der Analyten auswirkt. Schwache Hydroxid-Eluenten sind von diesem Problem besonders betroffen, da die Elutionskraft von Carbonat-Ionen viel stärker ist als die von Hydroxid-Ionen, was zu starken Verschiebungen der Retentionszeiten führt. Daher sind mehrwertige Ionen stärker davon betroffen als einwertige Ionen. Dieses Problem kann durch die Herstellung eines frischen Eluenten und die Verwendung eines CO2-Adsorbers behoben werden. Bei der Arbeit mit Hydroxid-Eluenten ist es außerdem wichtig, den Zustand der Hydroxid-Stammlösung zu überprüfen, da diese CO2 aus der Luft absorbieren kann. Abbildung 1 zeigt die Auswirkung der CO2-Aufnahme aus der Luft auf die Retentionszeiten der gängigen Anionen.

Einige Proben können Bestandteile enthalten, die die Ionenaustauschgruppen des Säulenmaterials besetzen. In diesem Fall ist die Anzahl der verfügbaren Ionenaustauschgruppen auf der Säule im Vergleich zum Ausgangszustand reduziert, was zu einer scheinbar geringeren Säulenkapazität und kürzeren Retentionszeiten führt. Je nach Art der Verunreinigung(en) gibt es Möglichkeiten, diesen Effekt umzukehren und sie von der Säulenoberfläche zu waschen. Diese Regenerationsverfahren sind individuell an die verschiedenen stationären Phasen angepasst und sollten als letzte Möglichkeit zur Rettung einer Säule genutzt werden.

Die Verfahren sowie die Betriebsgrenzen sind in der jeweiligen Bedienungsanleitung der Säule beschrieben und können auf unserer Website eingesehen werden. Bitte konsultieren Sie Ihren Metrohm-Händler, bevor Sie eine Regenerationsprozedur durchführen.

 Handbuch für Metrosep A Supp 17

• Handelt es sich bei der Verunreinigung um ein mehrwertiges Ion, ist es in der Regel möglich, dieses durch Spülen der Säule mit einem Elutionsmittel höherer Konzentration runterzuspülen. Vergessen Sie dabei nicht die Betriebsgrenzen der Säule, insbesondere den pH-Wert des Elutionsmittels.
• Manchmal können organische Moleküle aufgrund ihrer starken Affinität zur stationären Phase der Säule adsorbieren. Dies kann zu einer Blockierung der Ionenaustauschergruppen und zu verringerten Retentionszeiten sowie zu einem erhöhten Betriebsdruck führen. In diesem Fall kann es hilfreich sein, die stationäre Phase mit einem Eluenten zu waschen, der einen Anteil eines organischen Modifiers enthält. Dies erhöht die Affinität der Verunreinigung zur mobilen Phase und hilft, sie von der stationären Phase abzulösen.

In der Regel kann nach einem solchen Regenerationsverfahren die ursprüngliche Säulenkapazität wiederhergestellt werden.

Eine noch bessere Möglichkeit, die Lebensdauer der Trennsäule zu verlängern, ist der regelmäßige Austausch der Vorsäule. Sie hat unter anderem die Aufgabe, die Trennsäule vor Verunreinigungen zu schützen, indem sie diese zurückhält.

Achten Sie darauf, die Vorsäule während der Lebensdauer der Trennsäule drei- bis viermal auszutauschen, oder sogar noch häufiger, wenn Sie mit sehr komplexen Probenmatrizes wie Farbstoffen oder Lebensmittelmatrizes arbeiten. In diesen Fällen empfehlen wir die Verwendung der Metrosep RP 2 Guard/3.5.

Metrosep RP 2 Guard/3.5

Die Überlagerung der Chromatogramme in Abbildung 2 zeigt die Auswirkungen einer defekten Vorsäule auf die Peakform.

In einigen Fällen wird die Säulenkapazität durch eine chemische Veränderung der stationären Phase verringert. Dies geschieht, wenn eine Säule unter Bedingungen verwendet wird, die außerhalb der Betriebsgrenzen liegen, z. B. bei extremen pH-Werten. Extreme pH-Bedingungen können die chemischen Bindungen der Ionenaustauschgruppen an das Substrat der Basispartikel verändern. Dieser irreversible Prozess führt zu einem dauerhaften Kapazitätsverlust der Säule. In diesem Fall kann kein Regenerationsverfahren die ursprüngliche Säulenkapazität wiederherstellen.

Bitte beachten Sie, dass dieser Verlust von Ionenaustauschergruppen auch bei regelmäßiger Verwendung von Ionenaustauschersäulen langsam erfolgt. Die Stärke der chemischen Bindung der Ionenaustauschergruppen wird bei der Entwicklung der Metrohm-Säulen gründlich getestet, um eine lange Lebensdauer der Säulen zu gewährleisten.

Theoretische Böden und Peaksymmetrie

Die Anzahl der theoretischen Böden (TP) kann ein nützliches Instrument zur Beurteilung des Packungszustands der Säule sein. Je höher der TP-Wert ist, desto besser ist die Packung der Säule. Für eine aussagekräftige Beurteilung der Säulenpackung wählen Sie einen Analyten, der nicht zu früh im Chromatogramm eluiert (diese Peaks können durch Extrasäuleneffekte beeinflusst werden, insbesondere bei 2-mm-Systemen) und der nicht durch sekundäre Wechselwirkungen beeinträchtigt wird (d. h. vermeiden Sie Nitrat). Für Kationen eignet sich Kalium, während für Anionen Sulfat eine geeignete Wahl ist.

Obwohl die Säulen bei einem Druck gepackt werden, der höher ist als der normale Betriebsdruck, verdichtet sich das Packungsbett während der gesamten Lebensdauer der Säule durch die kontinuierliche Anwendung der fließenden mobilen Phase (Eluent) weiter. Während sich das Packungsbett der stationären Phase aufgrund dieses Effekts verbessert, kann dies auch zu einem gewissen Totvolumen am Eingang der Trennsäule führen. Dieses Totvolumen kann zu einer Verbreiterung der Peaks und einer Verringerung der theoretischen Böden führen, insbesondere zu Beginn des Chromatogramms.

Obwohl es sich hierbei um einen normalen Alterungsprozess der Säule handelt, ist es möglich, ihn durch gute Pflege der Säule zu verlangsamen. Zu den vorbeugenden Maßnahmen gehören die langsame Einleitung der Eluentenflussrate und -temperatur beim Start sowie das ordnungsgemäße und vollständige Abschalten der Hochdruckpumpe vor dem Ausbau der Säule, da mechanische Belastungen dem Säulenbett schaden können. Der Austausch der Vorsäule kann sich oft positiv auf die theoretischen Böden und Peakformen auswirken (siehe Abbildung 2).

Probleme mit dem Säulenbett werden oft auch in den Werten des Asymmetriefaktors und den Peakformen sichtbar. Ein ausgeprägteres Fronting sowie eine Peakverbreiterung können Warnzeichen für ein Channeling in der Säule oder der Vorsäule sein. Leider sind derartige Schäden an der Säule irreversibel und erfordern einen Austausch der Trennsäule.

Vor dem Austausch der Säule ist es wichtig zu prüfen, ob die Probleme von der Säule oder einer anderen Verbindung im IC-System herrühren, wenn eine Peakverbreiterung im Chromatogramm beobachtet wird. Vergewissern Sie sich, dass alle Kapillaren im Hochdruckpfad einen Durchmesser von ≤0,25 mm haben und dass alle Kapillaren korrekt und ohne zusätzliches Totvolumen installiert und angeschlossen sind. Systeme, die mit Säulen mit kleinem Innendurchmesser (2 mm, Microbore) ausgestattet sind, werden durch das Totvolumen stärker beeinträchtigt als solche mit 4-mm-Säulen. Das bedeutet, dass bei der Verwendung von Microbore-Säulen weniger Totvolumen erforderlich ist, damit der Effekt der Peakverbreiterung sichtbar wird, als bei der Verwendung von 4 mm-Säulen.

Säulendruck

Ein weiterer wichtiger Parameter, der während der gesamten Lebensdauer der Säule regelmäßig überprüft werden muss, ist der Systemdruck. Hoher Druck ist einer der häufigsten Gründe für den Austausch der Säule. Wenn ein Druckanstieg festgestellt wird, ist es wichtig zu überprüfen, welcher Teil des IC-Systems die Ursache ist.

Wenn die Probe Partikel enthält und die Probenvorbereitung unzureichend ist, sammeln sich die Partikel am Eingang der Vorsäule an und führen schließlich zu einem erhöhten Systemdruck. In diesem Fall hat die Vorsäule ihre Aufgabe, die Trennsäule zu schützen, nicht mehr erfüllt und muss ersetzt werden. Wird die Vorsäule nicht früh genug ausgetauscht, können die Partikel durchbrechen und die Trennsäule belasten. Während es für eine mit Partikeln beladene Vorsäule kein Regenerationsverfahren gibt, können mit Partikeln verunreinigte Trennsäulen durch Spülen der Säule bei niedrigen Flussraten in umgekehrter Flussrichtung regeneriert werden.

Bitte beachten Sie, dass diese Regenerationsverfahren nicht immer erfolgreich sind.

Eine gute Möglichkeit zum Schutz der Vor- und Trennsäulen ist es, zu vermeiden, dass Partikel in den Hochdruckpfad des IC-Systems injiziert werden. Metrohm bietet mehrere automatisierte Probenvorbereitungstechniken an, die sich positiv auf die Lebensdauer der Säule auswirken. Die gängigsten Techniken für diesen Zweck sind die Inline-Ultrafiltration (Abbildung 3) und die Inline-Dialyse.

Erfahren Sie mehr über die Inline-Ultrafiltration von Metrohm in unserem entsprechenden Blogbeitrag.

Wann muss ich bei der Inline-Ultrafiltration die Filtrationsmembran austauschen?

Ende der Lebensdauer der Säule

Alle oben beschriebenen Parameter sollten berücksichtigt werden, um die Leistung der Säule (und des IC-Systems) zu beurteilen. Viele dieser Parameter können in der MagIC Net-Software genau überwacht werden, so dass ein mögliches Problem so früh wie möglich erkannt werden kann.

Obwohl Metrohm-IC-Säulen für eine sehr lange Lebensdauer konzipiert und hergestellt werden, lässt die Leistung irgendwann nach, und selbst Regenerationsverfahren können unter Umständen nicht mehr die erforderliche Säulenleistung erbringen, um die Anforderungen der Anwendung zu erfüllen. Dies bedeutet das Ende der Säulenlebensdauer und macht den Austausch der Trennsäule unumgänglich.

Metrohm-Trennsäulen sind nicht recyclebar und können mit dem normalen Abfall entsorgt werden. Abhängig von den gemessenen Proben sowie den verwendeten Chemikalien und den damit verbundenen Gefahren kann es jedoch notwendig sein, eine geeignete Entsorgungsmöglichkeit in Betracht zu ziehen.

Unabhängig von der Art der Probe darf die Säule zu keinem Zeitpunkt geöffnet werden.

Übersicht zur Fehlerbehebung

Tabelle 1 gibt einen Überblick über bestimmte Strategien zur Fehlerbehebung bei der Untersuchung des Leistungsverhaltens Ihrer Säule.

Fazit

In diesem Artikel wurde erläutert, wie die Leistung einer IC-Säule während ihrer gesamten Lebensdauer bewertet und überwacht werden kann und welche Maßnahmen getroffen werden können, um eine lange Lebensdauer der Säule zu gewährleisten. Damit schließen wir nun die Serie "Best Practice für Trennsäulen in der Ionenchromatographie" ab. Sollten Sie weitere Fragen haben, zögern Sie nicht, Ihren lokalen Metrohm-IC-Verkäufer zu kontaktieren.

Ihre Wissens-Take-aways

Tipps und Tricks für IC-Säulen