Point-of-Care mit Raman: Erkennung von Krebs, Infektionen und mehr

Die medizinische Industrie ist ein neues Betätigungsfeld für die Raman-Spektroskopie. In den letzten Jahren wurde die Raman-Spektroskopie in der Zahn- und Krebsforschung eingesetzt und baut nun auf diesem Erfolg auf, indem sie auf Point-of-Care-Anwendungen (POC) ausgeweitet wird. Dieser Artikel gibt einen Überblick über einige sehr neue und spannende Forschungsarbeiten zur Nutzung der Raman-Spektroskopie für den Nachweis von Krebsgewebe, Biomarkern für Krankheiten und Krankheitserregern.

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Erkennung von Knocheninfektionen mit einem tragbaren Raman-Spektrometer
Raman-Spektroskopie zur Krebserkennung
Traditionelle Raman-Spektroskopie zur Beurteilung von Brustkrebs
SERS zur Erkennung und Messung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Biomarkern
Schneller Point-of-Care (POC)-Assay zum Nachweis von COVID-19 auf Femtogrammebene
Multiplex-Immunphänotypisierung von Blut- und Brustkrebszellen mittels Raman-Spektroskopie
Einfacher Nachweis von Enzymen mit dem elektrochemischen SERS-Effekt

Erkennung von Knocheninfektionen mit einem tragbaren Raman-Spektrometer

Infektionsbedingte Komplikationen sind ein ernstes Problem bei der Verwendung menschlicher Knochentransplantate in der muskuloskelettalen Chirurgie. Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus sind die häufigsten Übeltäter bei knochenbedingten Infektionen, und die Behandlung dieser Bakterien ist äußerst schwierig.

Der Nachweis von Staphylokokken auf Transplantatmaterial und die Unterscheidung zwischen gesundem und krankem Knochen sind entscheidend für die Vermeidung von Infektionen. Bei Laborkulturen dauert es in der Regel 7-10 Tage, bis Ergebnisse vorliegen, und es besteht das Risiko einer Kontamination während des Transports und der Untersuchung. In positiven Fällen muss der Patient rückwirkend mit massiven Dosen von Antibiotika behandelt werden. Eine ideale Lösung für diese Herausforderung ist eine Vor-Ort-Analyse, die es dem Operationsteam ermöglicht, kranke Knochen an Ort und Stelle zu identifizieren und zu vermeiden.

Kürzlich hat eine Forschergruppe in Österreich gezeigt, dass sie mit einem tragbaren MIRA-Raman-Spektrometer erfolgreich zwischen gesunden und infizierten Knochenproben sowie zwischen zwei Arten von Staphylokokken unterscheiden kann [1]. Ihr Verfahren analysierte die Fingerabdruck-Raman-Banden von Phosphaten, Amiden und Kollagenen sowie deren unterschiedliche Intensitäten und Peakbreitenverhältnisse, um zwischen gesunden und kranken Knochen zu unterscheiden. Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) unterstützte die optische Analyse und wurde zur genaueren Unterscheidung von Staphylokokkenstämmen verwendet.

Die österreichische Gruppe schätzte, dass MIRA "leicht, kompakt und batteriebetrieben" ist und dass die Raman-Spektroskopie den Vorteil "minimaler Probenvorbereitung und schneller Ergebnisse" hat. Die Tests erforderten nur eine winzige Knochenprobe für die In-situ-Untersuchung während der Operation und lieferten schnelle und genaue Ergebnisse direkt im Operationssaal.

Raman-Spektroskopie zur Krebserkennung

Die "molekularen Fingerabdrücke" der Raman-Spektroskopie können empfindlich genug sein, um chemische Veränderungen zu erkennen, die mit Krankheiten einhergehen. Kompakte Raman-Spektrometer können Chirurgen bei der Beurteilung von Tumoren während chirurgischer Eingriffe helfen, um schneller Entscheidungen treffen zu können. In den folgenden Abschnitten werden Anwendungsbeispiele für Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs erörtert.

Traditionelle Raman-Spektroskopie zur Beurteilung von Brustkrebs

Bei Verdacht auf Brustkrebs ist in der Regel eine Operation zur Biopsie und eine zweite zur Entfernung des bösartigen Tumors erforderlich. Die Möglichkeit, verdächtiges Gewebe bereits während der ersten Operation zu beurteilen, ermöglicht eine sofortige Entfernung, falls erforderlich. Der Nutzen für den Patienten und die medizinische Industrie ist unschätzbar - und die Forschung deutet darauf hin, dass die Raman-Spektroskopie diesen Bedarf bei einigen Krebsarten decken kann.

Die Raman-Spektroskopie ist empfindlich genug, um Veränderungen im Gewebe zu erkennen, die bei vielen Krebsarten auftreten. So gibt es beispielsweise sehr feine Unterschiede in den Raman-Spektren von gesundem Brustgewebe und bösartigen Tumoren. Forscher im Vereinigten Königreich verwendeten ein hochauflösendes i-Raman-Laborgerät (Abbildung 1) und multivariate Werkzeuge, einschließlich PCA, zur erfolgreichen Unterscheidung von gesundem und krebsartigem Gewebe [2].

Abbildung 1. Das tragbare Raman-Spektrometer i-Raman Prime 785S von Metrohm.

SERS zur Erkennung und Messung von Bauchspeicheldrüsenkrebs-Biomarkern

SERS (oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie) kann eine Lösung sein, wenn Standard-Raman für die Analyse nicht ideal ist. Dies kann der Fall sein, wenn sich das Zielobjekt in einer komplexen Probenmatrix befindet oder aufgrund der Fluoreszenz von Molekülen auf Kohlenstoffbasis. SERS verstärkt das Raman-Signal, aber nicht das konkurrierende Fluoreszenzsignal. Außerdem ermöglicht der SERS-Effekt eine empfindliche Detektion von Analyten in mg/L-Konzentrationen - manchmal bis hinunter zu µg/L. Schließlich sind die SERS-Peaks scharf und gut definiert, was eine effiziente Detektion und Identifizierung der Zielanalyten ermöglicht.

Wenn Sie mehr über SERS erfahren möchten, lesen Sie unseren früheren Blogbeitrag zu diesem Thema.

Raman vs. SERS… Was ist der Unterschied?

Bauchspeicheldrüsenkrebs ist tödlich, auch weil er schwer zu diagnostizieren ist. Es gibt jedoch einige Biomarker, die in ~75 % der positiven Fälle in erhöhter Konzentration vorhanden sind [3]. Diese können mit Enzymimmunoassays (ELISA) nachgewiesen werden, mit denen eine Vielzahl von Biomarkern, darunter Antikörper, Antigene und Proteine, gemessen werden.

In einer neuen Technik wurde an der Universität von Utah ein i-Raman-Laborspektrometer für die SERS-Analyse in Verbindung mit ELISA eingesetzt, um ein mit Bauchspeicheldrüsenkrebs assoziiertes Antigen nachzuweisen [2]. Das SERS-Signal wurde von einem Reportermolekül erzeugt, das sowohl mit einem Goldnanopartikel als auch mit dem Zielanalyten in einem ansonsten klassischen Lateral-Flow- oder "Sandwich"-Immunoassay komplexiert war (Abbildung 2). Es handelt sich um eine unglaublich genaue Technik, die einen sehr empfindlichen Nachweis - mit der Möglichkeit der Quantifizierung - des interessierenden Biomarkers ermöglicht.

Abbildung 2. Der Nachweis eines mit Bauchspeicheldrüsenkrebs assoziierten Antigens ist mit oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS) möglich.

Schneller Point-of-Care (POC)-Assay zum Nachweis von COVID-19 auf Femtogrammebene

Abbildung 3. MIRA XTR, ein tragbares Raman-Spektrometer von Metrohm.

Ein alternatives ELISA-Format wurde von Forschern der University of Wyoming zum Nachweis von Antigen-Biomarkern im Zusammenhang mit einer COVID-19-Infektion verwendet [4]. In dieser Studie wurde ein von magnetischen Nanopartikeln getragener Assay verwendet, um den Ziel-Biomarker in Lösung zu konzentrieren und anschließend mit MIRA XTR per SERS nachzuweisen (Abbildung 3). Er erwies sich als empfindlicher als kommerzielle Lateral-Flow-Assays, war sowohl mit Lösungsmittel- als auch mit Speichelproben kompatibel, konnte an neue Virusvarianten angepasst werden und ermöglichte eine hochempfindliche POC-Diagnose von COVID-19.

Lateral-Flow-Immunoassays liefern relativ schnelle Ergebnisse, liefern aber Nachweise im Nanogramm-Bereich und haben Einschränkungen bei der Quantifizierung. Im Vergleich dazu ist der SERS-basierte ELISA empfindlich für Antigenmengen im Femtogramm-Bereich und liefert mit einem handelsüblichen Raman-Handgerät schnelle Ergebnisse am Point of Sale.

Multiplex-Immunphänotypisierung von Blut- und Brustkrebszellen mittels Raman-Spektroskopie

In einer anderen Studie wurde MIRA DS verwendet, um einen tragbaren SERS-basierten ELISA für die Immunphänotypisierung verschiedener Arten von Oberflächen roter Blut- und Brustkrebszellen zu bewerten [5]. Die Unterscheidung zwischen gesunden und kranken Zellen und die Erkennung mehrerer Biotargets in einer Probe kann eine fundierte Behandlung verschiedener Arten von Brustkrebs unterstützen.

Dieser Test wies "Spezifität, Empfindlichkeit und Wiederholbarkeit für die Immunphänotypisierung in verschiedenen Zelltypen auf, [wobei] im Vergleich zu herkömmlichen Multiplex-Immunoassays ein kleineres Analyseprobenvolumen verwendet wurde", und er war weniger "arbeitsintensiv und technisch einfach durchzuführen". Die Autoren lobten den Orbitalen Raster Scan von MIRA für die Verbesserung der Empfindlichkeit ihres Assays durch einen größeren Bereich der Abfrage und räumlich gemittelte Messungen.

Herkömmliche Multiplexing-Durchflussassays können durch die Verfügbarkeit verschiedenfarbiger Färbungen und die schwierige Interpretation der Ergebnisse eingeschränkt sein. Außerdem sind sie mit einem großen Platzbedarf im Labor verbunden. Im Gegensatz dazu bietet diese auf der tragbaren Raman-Spektroskopie basierende Methode das Potenzial für genaue POC-Ergebnisse mit einer kurzen Probe-zu-Ergebnis-Zeit, Multiplexing-Fähigkeit und einem sehr kompakten Instrument.

Einfacher Nachweis von Enzymen mit dem elektrochemischen SERS-Effekt

Abbildung 4. Das SPELECRAMAN638-Gerät von Metrohm führt spektroelektrochemische Raman-Messungen mit einem 638-nm-Laser durch.

Eine ganz andere SERS-Technik zur Charakterisierung biologischer Moleküle wurde von Metrohm [6] vorgestellt. Die elektrochemische SERS (EC-SERS) ermöglicht zwei Experimente auf einmal: die elektrochemische Aktivierung der SERS-Merkmale von Silberelektroden (Ag SPEs) und den anschließenden spektroskopischen Nachweis der Probe (mit SPELECRAMAN638, Abbildung 4).

Hier wird das SERS-Substrat in-situ aus Silberelektroden (sowohl siebgedruckten als auch herkömmlichen) erzeugt. Dies geschieht in Anwesenheit des Analyten und unter kontinuierlicher Abfrage mit Raman, um den Nachweis der SERS-aktiven Spezies zu optimieren. Die Anregung bei 638 nm sorgt für einen SERS-Effekt mit guter Intensität, bei geringerem Risiko der Probenbeschädigung und Fluoreszenz.

Die Bestimmung der Struktur von Enzymen (und ihrer Rolle bei Krankheiten) wie der Aldehyddehydrogenase (ALDH) trägt zum Verständnis von Krankheiten bei. Mit EC-SERS definierten Anwendungswissenschaftler bisher unbekannte Fingerprint-Raman-Banden von ALDH in Lösung. In ähnlicher Weise liefern die Redoxzustände von Cytochrom c Informationen über den Elektronentransport durch Zellmembranen [7]. Cytochrom c ändert während des EC-Experiments seinen Oxidations- und Konformationszustand, und diese Redoxzustände weisen unterscheidbare SERS-Spektren auf.

Fazit

Die Raman-Technologie wird wirklich auf innovative Weise genutzt. Forschungsgruppen auf der ganzen Welt nutzen ihre beträchtlichen Vorteile - wie Empfindlichkeit, Spurendetektion, kleiner Formfaktor und schnelle Ergebnisse - für den Nachweis von Krebsgewebe, Krankheits-Biomarkern und krankheitsverursachenden Erregern. Die Ergebnisse sind unglaublich spannend und vielversprechend!

[1] Lindtner, R. A.; Wurm, A.; Pirchner, E.; et al. Enhancing Bone Infection Diagnosis with Raman Handheld Spectroscopy: Pathogen Discrimination and Diagnostic Potential. IJMS 2023, 25 (1), 541. DOI:10.3390/ijms25010541

[2] Thomas, R.; Bakeev, K.; Claybourn, M.; Chimenti, R. The Use of Raman Spectroscopy in Cancer Diagnostics. Spectroscopy 2013, 28 (9), 36–43.

[3] Goonetilleke, K. S.; Siriwardena, A. K. Systematic Review of Carbohydrate Antigen (CA 19-9) as a Biochemical Marker in the Diagnosis of Pancreatic Cancer. Eur J Surg Oncol 2007, 33 (3), 266–270. DOI:10.1016/j.ejso.2006.10.004

[4] Antoine, D.; Mohammadi, M.; Vitt, M.; et al. Rapid, Point-of-Care ScFv-SERS Assay for Femtogram Level Detection of SARS-CoV-2. ACS Sens. 2022, 7 (3), 866–873. DOI:10.1021/acssensors.1c02664

[5] Wang, J.; Koo, K. M.; Trau, M. Tetraplex Immunophenotyping of Cell Surface Proteomes via Synthesized Plasmonic Nanotags and Portable Raman Spectroscopy. Anal. Chem. 2022, 94 (43), 14906–14916. DOI:10.1021/acs.analchem.2c02262

[6] Metrohm AG. Easy Detection of Enzymes with the Electrochemical-SERS Effect; AN-RA-008; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[7] Brazhe, N. A.; Evlyukhin, A. B.; Goodilin, E. A.; et al. Probing Cytochrome c in Living Mitochondria with Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Sci Rep 2015, 5 (1), 13793. DOI:10.1038/srep13793

Ihr Wissen zum Download

Application Note: Der Einsatz der Raman-Spektroskopie im Bereich der Krebsdiagnostik

Application Note: Einfache Erkennung von Enzymen mit dem elektrochemischen SERS-Effekt – Die Aktivierung verbesserter Eigenschaften von Silberelektroden hilft dabei, charakteristische Raman-Banden biologischer Moleküle zu erhalten

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Blog: Raman-Spektroelektrochemie von Indien bis Spanien: Geschichte und Anwendungen

Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) – Erweiterung der Grenzen der konventionellen Raman-Analyse

Bei der oberflächenverstärkten Raman-Streuung (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) handelt es sich um eine anomale Verstärkung der Raman-Streuung, wenn Moleküle an Gold- oder Silber-Nanopartikel adsorbiert werden - diese Verstärkung kann bis zu 1e+7 betragen. Der Vorteil von SERS für den analytischen Chemiker liegt in der Fähigkeit, Analytkonzentrationen von mg/L (ppm) und sogar µg/L (ppb) zu erkennen, während die klassische Raman-Streuung auf g/L (ppt) beschränkt ist. Metrohm Raman stellt P-SERS-Tests in Form von Nanopartikeln her, die mithilfe von Tintenstrahltechnologie auf Substrate gedruckt werden. Mit dieser Methode werden kostengünstige Teststreifen hergestellt, die sich durch außergewöhnliche Stabilität und Empfindlichkeit auszeichnen. Es gibt zwei Märkte, die sich mit P-SERS leicht erschließen lassen: die forensische Analyse und die Lebensmittelsicherheit. In diesem White Paper wird der Mechanismus von SERS erläutert und erklärt, wie er für die tragbare Raman-Analyse mit den Raman MIRA-Systemen von Metrohm eingesetzt werden kann.

Autor

Dr. Melissa Gelwicks

Marketing-Spezialistin
Metrohm Raman (eine Abteilung von Metrohm Spectro), Laramie, Wyoming (USA)