La espectroscopia Raman es una de las técnicas de análisis químico más prometedoras. Esto se debe a sus propiedades inherentes de huellas dactilares que permiten la identificación de diferentes especies presentes en un sistema estudiado.
Aunque la baja sensibilidad ha limitado su uso como método de detección, el efecto de dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) ha mejorado su eficacia para uso analítico. La mejora de la señal Raman ha permitido el desarrollo de muchas aplicaciones de detección. En particular, la energía proporcionada por el láser de 638 nm garantiza un equilibrio entre el riesgo de dañar la muestra y la generación de fluorescencia, lo que hace que este láser sea popular para la mayoría de las aplicaciones biológicas.
En esta nota de aplicación, la aldehído deshidrogenasa y el citocromo c se analizan mediante espectroelectroquímica Raman como prueba de concepto.
Las mediciones se realizaron utilizando un instrumento SPELEC RAMAN 638 (láser de 638 nm), una sonda Raman correspondiente a la longitud de onda del láser y celdas espectroelectroquímicas para electrodos serigrafiados (Figura 1a) así como para electrodos convencionales (Figura 1b).
a)
b)
Se utilizaron electrodos serigrafiados con plata (Ag SPE, C013) como sustrato de SERS debido a sus propiedades de activación electroquímica. Además, también se utilizó un electrodo de trabajo de plata convencional (6.09395.044) como sustrato de SERS en combinación con electrodos contadores y de referencia de acero (6.0343.110) y Ag/AgCl (6.0728.120), respectivamente.
El SPELEC RAMAN 638 se controló con DropView SPELEC, un software dedicado que proporciona información espectroelectroquímica e incluye herramientas para realizar un tratamiento y análisis adecuado de los datos recopilados. Todo el hardware y software utilizado para este estudio está compilado en tabla 1.
Tabla 1. Descripción general del equipo de hardware y software.
| Equipo | Número de artículo |
|---|---|
| Instrumento | SPELECRAMAN638 |
| Investigacion | RAMANPROBE638 |
| Celda espectroelectroquímica Raman para SPE | RAMANCEL |
| Celda espectroelectroquímica Raman para electrodos convencionales. | RAMANCELL-C |
| SPE de plata | C013 |
| Cable de conexión para SPEs | ELENCO |
| Electrodo de trabajo de plata | 6.09395.044 |
| Contraelectrodo de acero | 6.0343.110 |
| Electrodo de referencia Ag/AgCl | 6.0728.120 |
| Cable de conexión para electrodos convencionales. | CABSTATO |
| Software | DropView SPELEC |
Se empleó espectroelectroquímica Raman para la detección de aldehído deshidrogenasa (ALDH) en solución acuosa. El protocolo SERS electroquímico (EC-SERS) requiere dos pasos en un solo experimento: la activación electroquímica de las características SERS de Ag SPE y luego la detección espectroscópica de la muestra.
La activación electroquímica consiste en escanear el potencial desde +0,50 V para producir la oxidación inicial de la superficie de plata, seguida de su reducción hasta -0,60 V para generar nanoestructuras con efecto SERS. El experimento espectroelectroquímico se realiza en presencia del analito a detectar (en este caso ALDH), pero los iones cloruro también están presentes en solución para favorecer la generación del sustrato SERS de plata.1].
Para evaluar la evolución de las bandas Raman durante todo el experimento, y por tanto optimizar la detección óptica, SPELEC RAMAN 638 realiza medidas en modo operando. De esta manera, los espectros se registran continuamente durante todo el experimento y no sólo a determinados potenciales.
Figura 2a muestra el voltamograma cíclico de ALDH, y el espectro Raman característico de ALDH se muestra en Figura 2b. Los resultados se obtuvieron para 1 mg/ml de ALDH en una solución acuosa de 0,1 mol/l de KCl. Aunque la adquisición de espectros se realizó de forma continua, el espectro Raman en Figura 2b se registró a -0,50 V ya que este potencial proporciona la intensidad Raman más alta.
a)
b)
La combinación del procedimiento EC-SERS propuesto para la fácil activación de Ag SPE con un instrumento espectroelectroquímico Raman (láser de 638 nm) ofrece una alternativa rápida e interesante para la caracterización de ALDH en solución no reportada previamente en la literatura.
También se utilizaron electrodos convencionales para la detección EC-SERS de diferentes enzimas como el citocromo c. El protocolo para este tipo de electrodo sigue los mismos pasos que para los SPE. Se requiere una oxidación inicial de la superficie seguida de una posterior reducción para generar nanoestructuras de plata con efecto SERS. La ventana de potencial se ajustó de acuerdo con los electrodos utilizados en este experimento. Los mejores resultados se obtuvieron escaneando el potencial de 0,1 mg/ml de citocromo c en una solución acuosa de KCl de 0,1 mol/l de +0,80 V a -0,80 V. El espectro Raman con mayor intensidad (figura 3) se registró a -0,70 V.
Las asignaciones de modos vibratorios de cada banda Raman del citocromo c se enumeran en Tabla 2.
Tabla 2. Asignación vibratoria del citocromo c [2,3].
| Bandas SERS del citocromo c (cm-1) | Asignación |
|---|---|
| 713 | Respiración hemo |
| 969 | Deformación asimétrica del pirrol |
| 1123 | Cβ-C1 |
| 1220 | Medio anillo de pirrol asimétrico |
| 1358 | Medio anillo de pirrol simétrico |
| 1426 | Cuarto de anillo de pirrol |
| 1528 | CαCm, CαN |
| 1578 | CβCβ, CαCm, |
| 1604 | CαCm, CαCβ |
Teniendo en cuenta que el citocromo c existe en formas reducidas y oxidadas interconvertibles, el estado de oxidación del ion Fe se puede determinar según la posición de sus bandas Raman características. El citocromo c reducido muestra una banda Raman centrada en 1604 cm-1, mientras que la forma oxidada muestra una banda desplazada hacia arriba centrada en 1636 cm-1. Según el espectro Raman (Figura 3) y las asignaciones vibratorias (Tabla 2), la forma reducida del analito se detecta durante el experimento EC-SERS. Este experimento demuestra la posibilidad de detectar el citocromo c y caracterizar su estado de oxidación.
La espectroelectroquímica Raman es una técnica de respuesta múltiple que proporciona resultados sobresalientes al estudiar una amplia variedad de sistemas. En el caso particular del láser de 638 nm, la energía proporcionada a esta longitud de onda es adecuada para aplicaciones biológicas.
En este trabajo, los protocolos electroquímicos propuestos para la activación de propiedades SERS de diferentes electrodos de plata (tanto serigrafiados como convencionales) ofrecen un procedimiento fácil y rápido para mejorar la intensidad Raman. Esta mejora de la intensidad Raman permite la detección de diferentes moléculas presentes en la solución. En este trabajo se definen bandas Raman de huellas dactilares de ALDH, no reportadas anteriormente. En el estudio del citocromo c, además de la caracterización del estado redox del ion Fe, se definen las bandas Raman características.
- Martín-Yerga, D.; Pérez-Junquera, A.; González-García, M. B.; et al. Quantitative Raman Spectroelectrochemistry Using Silver Screen-Printed Electrodes. Electrochimica Acta 2018, 264, 183–190. https://doi.org/10.1016/j.electacta.2018.01.060.
- Brazhe, N. A.; Evlyukhin, A. B.; Goodilin, E. A.; et al. Probing Cytochrome c in Living Mitochondria with Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Sci Rep 2015, 5 (1), 13793. https://doi.org/10.1038/srep13793.
- Hu, S.; Morris, I. K.; Singh, J. P.; Complete Assignment of Cytochrome c Resonance Raman Spectra via Enzymic Reconstitution with Isotopically Labeled Hemes. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115 (26), 12446–12458. https://doi.org/10.1021/ja00079a028.
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