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Supervisión y mantenimiento del rendimiento de la columna
Uno de los requisitos básicos para garantizar análisis cromatográficos fiables es una columna de separación de alto rendimiento. Los usuarios de cromatografía iónica (IC) deben comprobar periódicamente el rendimiento de su columna. De esta manera, si se manifiesta una caída en el rendimiento, se pueden tomar medidas con tiempo suficiente para restaurar o mantener el funcionamiento adecuado de la columna, reduciendo los tiempos de inactividad en el rendimiento de la muestra. En esta publicación de blog, explicamos cómo puede evaluar el rendimiento de la columna, qué parámetros debe monitorear y qué medidas puede tomar para garantizar un excelente rendimiento de la columna.
Uso por primera vez de una nueva columna de separación
Cuando utilice una columna por primera vez, le recomendamos que compruebe su rendimiento inicial. El Certificado de análisis (CoA), que recibe con cada compra de una columna Metrohm, es su fuente de referencia aquí. Registre un cromatograma y utilice las condiciones de análisis especificadas en el CoA: estas incluyen tasa de flujo, temperatura, eluyente (fase móvil), concentración de analito, muestra tamaño del bucle, y supresión.
Puede evaluar el rendimiento de la columna comparando algunos de los parámetros de resultados con los valores enumerados en el CoA (p. ej., tiempo de retención, platos teóricos, asimetría, resolución y altura de pico).
Supervisión periódica del rendimiento de la columna
¡Las columnas que ya están en uso también deben monitorearse regularmente! Recomendamos realizar estas pruebas con patrones de control en las condiciones de aplicación que normalmente utiliza, ya que el rendimiento varía según el tipo de analisis y asociados condiciones de análisis así como el configuración instrumental. Si se observa una reducción en el rendimiento, los requisitos de la aplicación son cruciales para determinar si aún se puede usar.
A continuación, explicamos cómo determinar el rendimiento de su columna en función de cinco indicadores de desempeño. También descubrirá cómo puede prevenir o corregir una disminución en el rendimiento.
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Contrapresión
Supervise la contrapresión: cuando utilice su nueva columna por primera vez, guarde el valor de la contrapresión en las condiciones de análisis de su aplicación como referencia («variable común» en MagIC Net). Luego use los resultados definidos por el usuario para monitorear la diferencia entre la contrapresión inicial y la que se muestra durante la determinación actual.
Si identifica un aumento en la contrapresión en comparación con el valor inicial guardado, esto indica que se han depositado partículas en la precolumna o en la columna de separación. Si el aumento medido es superior a 1 MPa, se deben tomar medidas. Primero, debe verificar cuál de las columnas se ve afectada (protección versus separación). Si la precolumna está contaminada, debe reemplazarse, ya que esta es su función principal. Si la columna de separación se ve afectada, retírela del sistema, gírela y vuelva a instalarla, y luego enjuáguela durante varias horas en esta dirección de flujo invertida. Si esto no ayuda, le recomendamos enfáticamente que considere reemplazar la columna. Esto será fundamental si se alcanza la contrapresión máxima permitida para la columna.
Tiempo de retención
Para realizar un seguimiento de los cambios en el tiempo de retención (que indican una disminución en el rendimiento de la columna), se controla en el cromatograma el tiempo de retención del último pico del analito. El sulfato, por ejemplo, es adecuado para esto, ya que normalmente eluye justo al final de los cromatogramas de aniones estándar. Aquí también, trabaje con una variable común en MagIC Net para guardar el valor inicial.
Los tiempos de retención inestables pueden ser causados por el dióxido de carbono introducido desde el aire ambiente o por las burbujas de aire presentes en el eluyente. Afortunadamente, estos problemas se pueden resolver fácilmente. (ver tabla 1).
tabla 1. Prevención y corrección de la pérdida de rendimiento en columnas IC.
| Indicador | Causa | Medidas preventivas y correctivas |
|---|---|---|
| Contrapresión creciente | Partículas en la columna de guardia | Sustituya la precolumna. |
| Partículas en la columna de separación | Enjuague la columna de separación en la dirección de flujo inversa:
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| Partículas en la muestra | Preparación de muestras, p. ej., eliminación de partículas mediante ultrafiltración en línea | |
| Tiempo de retención reducido | Carbonato en el eluyente | El dióxido de carbono del aire afecta el equilibrio de carbonato/carbonato de hidrógeno en el eluyente. Un eluyente de carbonato/carbonato de hidrógeno se debilita con el tiempo; un eluyente de hidróxido fortalece.
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| Burbujas de aire en el eluyente | Las burbujas de aire hacen que el flujo de eluyente sea inestable. La contrapresión es un indicador de flujo inestable. Debe permanecer estable dentro de un rango de ± 0,1 MPa.
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| Pérdida de capacidad en la columna debido a iones de alta valencia | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito inorgánico. | |
| Pérdida de resolución | Eluyente demasiado viejo o producido incorrectamente | Los eluyentes deben estar recién preparados. Asegúrese de que se produzcan correctamente y, en particular, de que no se confundan el carbonato y el carbonato de hidrógeno. |
| Efecto adsortivo de la contaminación depositada en la precolumna | Sustituya la precolumna. | |
| Efecto adsortivo de la contaminación depositada en la columna de separación | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. | |
| Pérdida de placas teóricas | Columna de protección contaminada | Sustituya la precolumna. |
| Columna de separación contaminada | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. | |
| Columna de separación sobrecargada | La columna de separación puede sobrecargarse por factores como un alto contenido de sal en la matriz de la muestra.
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| Volumen muerto en el sistema IC |
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| Asimetría | Volumen muerto o contaminación en la precolumna | Sustituya la precolumna. |
| Columna de separación contaminada | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. |
La columna también puede haber perdido algo de capacidad. Esta pérdida de capacidad puede ser causada por la presencia de iones de alta valencia que son difíciles de eliminar debido a su fuerte atracción por la fase estacionaria. A continuación, la columna debe regenerarse de acuerdo con el prospecto de la columna para eliminar cualquier contaminación. Si esto no conduce a ninguna mejora, considere reemplazar la columna según los requisitos de la aplicación, particularmente en caso de pérdida progresiva de capacidad.
La pérdida de capacidad también puede ocurrir si los grupos funcionales se separan permanentemente de la fase estacionaria. En tal caso, la columna no puede regenerarse y debe reemplazarse.
Resolución
Supervise la resolución cromatográfica comparando las mediciones de un estándar de verificación predefinido con un valor de referencia inicial. Si la resolución es R > 1.5, la señal se considera separada por línea base (vea la ilustración a continuación). Sin embargo, en casos que involucran matrices altamente concentradas y para picos que están más dispersos, el valor de resolución debe ser mayor para asegurar la separación de la línea de base.
Si se produce una pérdida de resolución, primero asegúrese de que no sea causada por el eluyente o el sistema IC. Una vez que se han descartado, es posible que el efecto de adsorción de las contaminaciones en la precolumna o la columna de separación sea el responsable. Se debe reemplazar una precolumna contaminada. Si se determina que la causa del problema es la columna de separación, esta debe regenerarse de acuerdo con el prospecto de la columna para liberarla de cualquier contaminación orgánica o inorgánica. Si la pérdida de resolución avanza, es inevitable reemplazar la columna.
Placas teóricas
Guarde el número inicial de placas teóricas en MagIC Net como una variable común, como se mencionó anteriormente para otros parámetros. Por lo general, se utiliza el último pico de elución: en los cromatogramas de aniones, el sulfato volvería a demostrar ser un candidato adecuado. Las placas teóricas también dependen de la concentración del analito. Por lo tanto, es ideal monitorear este parámetro durante controlar estándar medidas y no durante las mediciones de muestras. Puede realizar un seguimiento del desarrollo de cualquier cambio en el número de placas teóricas a través de los resultados definidos por el usuario en MagIC Net.
Una disminución en las placas teóricas puede sugerir un volumen muerto en el sistema IC (tabla 1). También se puede observar un bajo número de platos teóricos si la columna ha sido sobrecargada por una alta concentración de sal en la matriz de la muestra, por ejemplo. Si los platos teóricos disminuyen en más del 20 %, esto indica que el rendimiento de la columna está disminuyendo. Dependiendo de los requisitos de la aplicación, es posible que sea necesario tomar medidas.
Si la columna de protección es la razón de la caída del rendimiento, debe reemplazarse. Si el problema está en la columna de separación, recomendamos regenerar la columna de acuerdo con el prospecto de la columna para eliminar cualquier contaminación orgánica o inorgánica. Si esto no ayuda, debería considerar reemplazar la columna, particularmente si se observa una tendencia hacia placas teóricas más bajas.
Asimetría
Determine la asimetría inicial de los analitos midiendo un estándar de verificación predefinido bajo las condiciones de análisis de su aplicación. Guárdelo como una variable común, luego realice un seguimiento de los resultados definidos por el usuario para observar el desarrollo de la asimetría a lo largo del tiempo. Los valores máximos aceptables para la asimetría varían según el analito. Por ejemplo, los picos de calcio y magnesio presentan inicialmente valores de asimetría relativamente altos.
La asimetría se define como la distancia desde la línea central del pico hasta el lado descendente del pico. (B en la siguiente figura) dividido por la distancia desde la línea central del pico hasta el lado ascendente del pico (A en la siguiente figura), donde ambas distancias se miden al 10% de la altura del pico. Algunas farmacopeas pueden usar otras cifras; verifique para asegurarse de los requisitos en su país.
AS >1 significa que un pico tiene una cola, y AS < 1 equivale al frente de pico. La cromatografía óptima se logra con asimetrías de pico lo más cercanas posible a 1. Como regla general, se considera que el rendimiento de la columna está en declive cuando la asimetría es AS >2 o AS <0,5. Dependiendo de los requisitos de la aplicación, se deben tomar medidas en este caso para mejorar la simetría y permitir una mejor integración.
El motivo de los altos valores de asimetría puede deberse al cromatógrafo de iones, por ejemplo, debido al volumen muerto. Si este no es el caso, es importante averiguar si la asimetría se debe a problemas con la precolumna o con la columna de separación. Si la precolumna provoca la asimetría, debe reemplazarse. Si es la columna de separación, primero debe regenerarse de acuerdo con el prospecto de la columna para eliminar cualquier contaminación orgánica o inorgánica. Si esto no ayuda, debería considerar reemplazar la columna. Si se puede observar una tendencia hacia valores de asimetría más altos, el reemplazo es inevitable.
Resumen
Hay muchas formas de estimar el rendimiento de la columna y realizar un seguimiento de las cifras concretas a lo largo de su vida útil. El mantenimiento adecuado puede prolongar la vida útil de la columna de separación, además de utilizar siempre una precolumna para una protección adicional. Para obtener más información, consulte nuestros otros artículos de blog sobre este tema.
