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La nostra dieta è fondamentale per la nostra salute. Negli ultimi anni, l'interesse per gli additivi alimentari e gli integratori alimentari come i prebiotici come i β-galattooligosaccaridi (GOS) è aumentato. La determinazione del contenuto totale di GOS negli alimenti e negli integratori è essenziale per soddisfare i severi requisiti di etichettatura e sicurezza degli alimenti. Il metodo più utilizzato per la determinazione del GOS totale si basa sull'idrolisi enzimatica per scomporre le molecole complesse in carboidrati semplici prima della loro analisi cromatografica. Questo articolo illustra il vantaggio di utilizzare un miglioramento del Metodo AOAC 2001.02 utilizzando la cromatografia ionica con rilevamento amperometrico (IC-PAD) e l'automazione completa del campione dopo l'idrolisi enzimatica.
Cosa sono i GOS?
I GOS sono catene di unità di galattosio con un'estremità di glucosio opzionale. Sono spesso naturalmente presenti in piccole quantità in vari cibi e bevande.
Inizialmente scoperti come costituenti principali del latte materno umano (presente fino a 12 g/l), i GOS vengono aggiunti come integratore prebiotico agli alimenti per neonati. Mostrano effetti bifidogenici, nel senso che supportano la crescita e il benessere dei batteri intestinali non patogeni.
Gli integratori GOS sono disponibili sia crudi, sia come polveri o sciroppi concentrati e vengono successivamente utilizzati dai produttori alimentari per arricchire i prodotti di consumo o venduti come integratori.
Requisiti di etichettatura GOS
La continua crescita dei mercati globali dei prebiotici e dei GOS è il risultato della crescente consapevolezza dei consumatori in merito ad un'alimentazione sana. Allo stesso modo, l'aumento della domanda per quanto riguarda la qualità degli alimenti ha portato a norme più rigorose e complete per l'etichettatura e la sicurezza degli alimenti (ad es. UE 1169/2011 e UE 2015/2283 ). Pertanto, la determinazione del contenuto totale dei GOS negli alimenti, negli integratori e nelle materie prime è essenziale per poter soddisfare tali requisiti.
Gli studi sugli effetti sulla salute del GOS raccomandano dosi massime inferiori a 30 g al giorno, anche se questo è molto più rigoroso per alimenti per neonati. In caso contrario, non ci sono altri limiti per quanto riguarda il contenuto di GOS negli alimenti o come integratori alimentari.
AOAC 2001.02
Il metodo più utilizzato per misurare i GOS totali nei prodotti alimentari è il metodo standard AOAC 2001.02. Questo metodo si basa sull'estrazione di GOS da un campione seguita dall'idrolisi enzimatica degli oligosaccaridi in monosaccaridi e dalle loro successive analisi con cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni con rilevamento amperometrico pulsato.
In AOAC, la cromatografia per anioni è indicata come HPAEC (cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni) ma qui lo semplificheremo con il termine generico di CIRCUITO INTEGRATO.
La chiave per AOAC 2001.02 è il confronto di una soluzione di controllo con una che è stata trattata e idrolizzata con un enzima (β-galattosidasi). L'enzima catalizza la scissione dei legami glicosidici e idrolizza GOS e lattosio in glucosio e galattosio. Le differenze di concentrazione di galattosio libero e lattosio determinate in queste due soluzioni vengono utilizzate per calcolare i GOS totali (Figura 1).
Miglioramenti al metodo AOAC
La preparazione del campione per AOAC 2001.02 è piuttosto complessa: una lacuna è l'incubazione della soluzione di riferimento con l'enzima disattivato (che è piuttosto costosa) per determinare le concentrazioni iniziali di carboidrati (Figura 1) anziché utilizzare l'estratto puro. Un altro punto critico è la procedura di diluizione del campione, che dovrebbe essere eseguita in acetonitrile, mentre gli standard sono basati su acqua ultrapura.
Qui, l'obiettivo era semplificare l'intera procedura per aumentare la facilità d'uso e l'efficienza complessiva del metodo.
Il metodo migliorato per l'analisi del contenuto totale di GOS utilizza l'estratto per misurare le concentrazioni iniziali di glucosio, galattosio e lattosio (Figura 1 Saggio 1). Tuttavia, l'enzima disattivato non è stato utilizzato e sono stati invece effettuati confronti per vedere se la sua presenza avesse alcun effetto sui risultati. Questo passaggio è stato eliminato dopo aver dimostrato risultati equivalenti a AOAC 2001.02 Assay 1 (con l'enzima disattivato), ma le spese chimiche e il lavoro manuale aggiuntivo sono ridotti. Il contenuto totale di GOS viene quindi calcolato dalle concentrazioni di analita nel test 1 (senza alcun enzima) e nel test 2 (estratto con l'enzima attivo) (figura 2).
Vuoi saperne più dettagli sull'applicazione? Scarica la nostra Application Note gratuita qui di seguito di analisi GOS totale negli alimenti con cromatografia ionica.
A parte l'utilizzo dell'enzima, il metodo ufficiale AOAC per l'analisi dei GOS totali suggerisce che gli standard siano preparati in acqua ultrapura (UPW) mentre i campioni devono essere diluiti con acetonitrile al 20%. È stato eseguito un esperimento di controllo per confrontare i risultati tra:
- Diluizioni in UPW valutato con UPW calibrazione ("opzione UPW")
- Diluizioni in acetonitrile valutato con UPW calibrazione (AOAC 2001.02)
- Diluizioni in acetonitrile valutato con acetonitrile calibrazione ("opzione ACN")
La riproducibilità del contenuto totale del GOS è stata confrontata tra le tre opzioni, con le opzioni di preparazione UPW e AOAC che hanno mostrato risultati simili. L'opzione ACN è risultata con contenuto GOS totale inferiore rispetto agli altri. Inoltre, l'acetonitrile non sembrava conferire un effetto stabilizzante al campioni. Ciò supporta il miglioramento del metodo dell'AOAC eseguendo diluizioni del campione con UPW invece di acetonitrile, risparmiando reagenti non necessari e limitando l'impronta chimica dell'analisi.
Risultati
Nel complesso, i soddisfacenti recuperi di variabilità, target e spike, insieme ai test di interferenza hanno dimostrato che il metodo modificato è prezioso e robusto. Con limiti di rilevazione (LOD) di 0,1 mg/L (galattosio) e 0,2 mg/L (glucosio, lattosio) in soluzione, anche bassi contenuti di GOS totali possono essere determinati con alta precisione.
Riassunto
Come metodo multicomponente, la cromatografia ionica con rilevamento amperometrico è un metodo di analisi molto selettivo, sensibile e robusto per i carboidrati senza ulteriori passaggi di derivatizzazione. In combinazione con il trattamento enzimatico è possibile quantificare anche carboidrati più complessi.
Questa ricerca presenta un aggiornamento del metodo AOAC standard per la determinazione del GOS totale negli alimenti. Con lo stesso principio (idrolisi enzimatica di molecole GOS complesse seguita da analisi cromatografica di carboidrati semplici), l'efficienza del metodo analitico è stata migliorata a favore del tempo di laboratorio e dei costi di gestione. Ulteriori passaggi di automazione (ad es. Metrohm Inline Dilution e calibrazioni automatiche) può migliorare ulteriormente l'efficienza del metodo.
Desideri maggiori informazioni sul metodo semplificato per i GOS totali tramite IC-PAD? Maggiori dettagli sul miglioramento del metodo AOAC 2001.02 riducendo il lavoro manuale di laboratorio ed eliminando costosi reagenti può essere trovato nel nostro articolo pubblicato in The Column da LC/GC (2021): Miglioramento su AOAC 2001.02: Determinazione GOS negli alimenti utilizzando HPAEC-PAD.
La tua conoscenza "take-aways"
Leggi il nostro articolo in LC/GC La colonna (2021)
Metrohm Inline Sample Preparation (MISP) per matrici di campioni difficili
