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Monitoraggio e mantenimento delle prestazioni delle colonne
Uno dei requisiti di base per garantire analisi cromatografiche affidabili è una colonna di separazione dalle prestazioni elevate. Gli utenti della cromatografia ionica (IC) dovrebbero controllare regolarmente le prestazioni della loro colonna. In questo modo, se si manifesta un calo delle prestazioni, è possibile intervenire con un tempo sufficiente per ripristinare o mantenere il corretto funzionamento della colonna, riducendo i tempi di inattività nel flusso del campione. In questo post del blog spieghiamo come valutare le prestazioni delle colonne, quali parametri monitorare e quali misure è possibile adottare per garantire prestazioni eccellenti delle colonne.
Primo utilizzo di una nuova colonna di separazione
Quando si utilizza una colonna per la prima volta, si consiglia di verificarne il rendimento iniziale. Il Certificato di Analisi (CoA), che ricevi con ogni acquisto di una colonna Metrohm, è la tua fonte di riferimento. Registrare un cromatogramma e utilizzare le condizioni di analisi specificate nel CoA: queste includono portata, temperatura, eluente (fase mobile), concentrazione dell'analita, campione dimensione del ciclo, e soppressione.
È possibile valutare le prestazioni della colonna confrontando alcuni dei parametri del risultato con i valori elencati nel CoA (ad es. tempo di ritenzione, piastre teoriche, asimmetria, risoluzione e altezza del picco).
Monitoraggio regolare delle prestazioni della colonna
Anche le colonne già in uso dovrebbero essere monitorate regolarmente! Si consiglia di eseguire questi test con standard di controllo nelle condizioni applicative normalmente utilizzate, poiché le prestazioni variano a seconda del tipo di analisi e delle condizioni di analisi associate nonché dell'impostazione strumentale. Se si osserva una riduzione delle prestazioni, i requisiti dell'applicazione sono fondamentali per determinare se può ancora essere utilizzata.
Di seguito, spieghiamo come determinare il rendimento della colonna in base a cinque indicatori di performance. Scoprirai anche come prevenire o correggere un calo delle prestazioni.
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Contropressione
Monitorare la contropressione: quando si utilizza la nuova colonna per la prima volta, salvare il valore di contropressione nelle condizioni di analisi della propria applicazione come riferimento («variabile comune» in MagIC Net). Quindi utilizzare i risultati definiti dall'utente per monitorare la differenza tra la contropressione iniziale e quella visualizzata durante la determinazione corrente.
Se si rileva un aumento della contropressione rispetto al valore iniziale salvato, ciò indica che le particelle si sono depositate nella colonna di guardia o nella colonna di separazione. Se l'incremento misurato è maggiore di 1 MPa, è necessario agire. Innanzitutto, dovresti controllare quale delle colonne è interessata (guardia vs. separazione). Se la colonna di guardia è contaminata, deve essere sostituita, poiché questa è la sua funzione principale. Se la colonna di separazione è interessata, rimuoverla dal sistema, girarla e reinstallarla, quindi risciacquarla per diverse ore in questa direzione di flusso invertito. Se questo non aiuta, ti consigliamo vivamente di prendere in considerazione la sostituzione della colonna. Ciò sarà essenziale se viene raggiunta la contropressione massima consentita per la colonna.
Tempo di ritenzione
Per tenere traccia delle variazioni del tempo di ritenzione (che segnalano una diminuzione delle prestazioni della colonna), nel cromatogramma viene monitorato il tempo di ritenzione dell'ultimo picco dell'analita. Il solfato, ad esempio, è adatto a questo, poiché di solito eluisce proprio alla fine dei cromatogrammi anionici standard. Anche in questo caso, lavora con una variabile comune in MagIC Net per salvare il valore iniziale.
Tempi di ritenzione instabili possono essere causati dall'anidride carbonica introdotta dall'aria ambiente o dalle bolle d'aria presenti nell'eluente. Fortunatamente, questi problemi possono essere risolti facilmente (vedere Tabella 1).
Tabella 1. Prevenire e correggere la perdita di prestazioni nelle colonne IC.
| Indicatore | Causa | Misure preventive e correttive |
|---|---|---|
| Aumento della contropressione | Particelle sulla colonna di guardia | Sostituire la colonna di protezione. |
| Particelle sulla colonna di separazione | Sciacquare la colonna di separazione nella direzione del flusso inverso:
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| Particelle nel campione | Preparazione del campione, ad esempio, rimuovere le particelle attraverso l'ultrafiltrazione in linea | |
| Tempo di conservazione ridotto | Carbonato nell'eluente | L'anidride carbonica dell'aria influisce sull'equilibrio carbonato/carbonato di idrogeno nell'eluente. Un eluente carbonato/carbonato di idrogeno si indebolisce nel tempo; un eluente di idrossido si rafforza.
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| Bolle d'aria nell'eluente | Le bolle d'aria rendono instabile il flusso dell'eluente. La contropressione è un indicatore di flusso instabile. Dovrebbe rimanere stabile entro un intervallo di ± 0,1 MPa.
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| Perdita di capacità nella colonna a causa di ioni ad alta valenza | Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi inorganici. | |
| Perdita di risoluzione | Eluente troppo vecchio o prodotto in modo errato | Gli eluenti devono essere preparati al momento. Assicurarsi che siano prodotti correttamente e in particolare che il carbonato e l'idrogenocarbonato non vengano confusi. |
| Effetto assorbente della contaminazione depositata nella colonna di guardia | Sostituire la colonna di protezione. | |
| Effetto assorbente della contaminazione depositata nella colonna di separazione | Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici. | |
| Perdita di piastre teoriche | Colonna di guardia contaminata | Sostituire la colonna di protezione. |
| Colonna di separazione contaminata | Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici. | |
| Colonna di separazione sovraccarica | La colonna di separazione può essere sovraccaricata da fattori quali un elevato contenuto di sale nella matrice del campione.
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| Volume morto nel sistema IC |
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| Asimmetria | Volume morto o contaminazione sulla colonna di guardia | Sostituire la colonna di protezione. |
| Colonna di separazione contaminata | Rigenerare la colonna come da foglio illustrativo della colonna per rimuovere eventuali depositi organici o inorganici. |
La colonna potrebbe anche aver perso una certa capacità. Questa perdita di capacità può essere causata dalla presenza di ioni ad alta valenza che sono difficili da rimuovere a causa della loro forte attrazione per la fase stazionaria. La colonna deve quindi essere rigenerata secondo il foglio illustrativo della colonna per rimuovere qualsiasi contaminazione. Se ciò non comporta alcun miglioramento, valutare la possibilità di sostituire la colonna in base ai requisiti dell'applicazione, in particolare in caso di perdita progressiva di capacità.
La perdita di capacità può verificarsi anche se i gruppi funzionali sono permanentemente staccati dalla fase stazionaria. In tal caso, la colonna non può essere rigenerata e deve essere sostituita.
Risoluzione
Monitorare la risoluzione cromatografica confrontando le misurazioni di uno standard di controllo predefinito con un valore di riferimento iniziale. Se la risoluzione è R > 1.5, il segnale è considerato separato dalla linea di base (vedi l'illustrazione sotto). Tuttavia, nei casi che coinvolgono matrici altamente concentrate e per picchi più diffusi, il valore di risoluzione deve essere maggiore per garantire la separazione della linea di base.
Se si verifica una perdita di risoluzione, assicurarsi innanzitutto che non sia causata dall'eluente o dal sistema IC. Una volta che questi sono stati esclusi, è possibile che l'effetto di assorbimento delle contaminazioni nella colonna di guardia o nella colonna di separazione possa essere responsabile. È necessario sostituire una colonna di protezione contaminata. Se la causa del problema risulta essere la colonna di separazione, questa deve essere rigenerata secondo il foglio illustrativo della colonna per liberarla da qualsiasi contaminazione organica o inorganica. Se la perdita di risoluzione progredisce, la sostituzione della colonna è inevitabile.
Piatti teorici
Salva il numero iniziale di piastre teoriche in MagIC Net come variabile comune, come accennato in precedenza per altri parametri. Di solito viene utilizzato l'ultimo picco di eluizione: nei cromatogrammi anionici, il solfato si rivelerebbe ancora una volta un candidato adatto. Le piastre teoriche dipendono anche dalla concentrazione dell'analita. Pertanto, è ideale monitorare questo parametro durante le misurazioni standard di controllo e non durante le misurazioni del campione. È possibile monitorare lo sviluppo di eventuali modifiche al numero di lastre teoriche tramite i risultati definiti dall'utente in MagIC Net.
Una diminuzione delle piastre teoriche può suggerire un volume morto nel sistema IC (Tabella 1). Un basso numero di piastre teoriche può essere osservato anche se la colonna è stata sovraccaricata, ad esempio, da un'elevata concentrazione di sale nella matrice del campione. Se le piastre teoriche diminuiscono di oltre il 20%, ciò indica che le prestazioni della colonna stanno diminuendo. A seconda dei requisiti dell'applicazione, potrebbe essere necessario intraprendere un'azione.
Se la colonna di protezione è la causa del calo delle prestazioni, dovrebbe essere sostituita. Se il problema riguarda la colonna di separazione, si consiglia di rigenerare la colonna secondo il foglio illustrativo della colonna per eliminare qualsiasi contaminazione organica o inorganica. Se questo non aiuta, dovresti considerare di sostituire la colonna, in particolare se si osserva una tendenza verso piastre teoriche inferiori.
Asimmetria
Determinare l'asimmetria iniziale degli analiti misurando uno standard di controllo predefinito nelle condizioni di analisi della propria applicazione. Salvalo come variabile comune, quindi tieni traccia dei risultati definiti dall'utente per osservare lo sviluppo dell'asimmetria nel tempo. I valori massimi accettabili per l'asimmetria variano a seconda dell'analita. Ad esempio, i picchi di calcio e magnesio presentano inizialmente valori di asimmetria relativamente elevati.
L'asimmetria è definita come la distanza dalla linea centrale del picco al lato discendente del picco (B nella figura sottostante) diviso per la distanza dalla linea centrale del picco al lato ascendente del picco (A nella figura sottostante), dove entrambe le distanze sono misurate al 10% dell'altezza del picco. Alcune farmacopee possono utilizzare altre cifre: controlla per essere sicuro dei requisiti nel tuo paese.
AS >1 significa che un picco ha una coda e AS < 1 equivale a fronte di picco. La cromatografia ottimale si ottiene con asimmetrie di picco il più vicino possibile a 1. Come regola generale, le prestazioni della colonna sono considerate in calo quando l'asimmetria è AS >2 o AS <0.5. A seconda dei requisiti dell'applicazione, in questo caso devono essere adottate misure per migliorare la simmetria e consentire una migliore integrazione.
Il motivo di elevati valori di asimmetria potrebbe essere dovuto al cromatografo ionico, ad esempio a causa del volume morto. In caso contrario, è importante verificare se l'asimmetria è causata da problemi con la colonna di guardia o con la colonna di separazione. Se la colonna di guardia causa l'asimmetria, dovrebbe essere sostituita. Se è la colonna di separazione, deve essere prima rigenerata secondo il foglio illustrativo della colonna per rimuovere qualsiasi contaminazione organica o inorganica. Se questo non aiuta, dovresti considerare di sostituire la colonna. Se è possibile osservare una tendenza verso valori di asimmetria più elevati, la sostituzione è inevitabile.
Riassunto
Esistono molti modi in cui è possibile stimare le prestazioni della colonna e tenere traccia delle cifre concrete nel corso della sua durata. Una corretta manutenzione può prolungare la durata della colonna di separazione, oltre a utilizzare sempre una colonna di protezione per una protezione aggiuntiva. Per ulteriori informazioni, dai un'occhiata ai nostri altri articoli del blog su questo argomento!
