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イオンクロマトグラフィーとサンプルろ過は密接に関連しています。この前処理ステップは、ほとんどのサンプルマトリックスで推奨されます。粒子、藻類、または細菌を IC システムに注入することは避けてください。これらは、IC装置と分離カラムの両方を危険にさらす可能性があります。サンプルは、ろ過や遠心分離などを用いて夾雑物や妨害マトリックス成分を除去するなどの作業を手作業で行われることがよくあります。IC 分析用にサンプルを前処理するより効率的な方法は、メトロームインライン サンプル前処理技術 (MISP) を使用してプロセスを自動化することです。メトロームインライン限外ろ過 (UF) またはインライン透析のいずれかを使用して、有害なマトリックス成分から IC システムを保護すると同時に、手作業を減らしてサンプルのスループットを向上させることができます。
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なぜイオンクロマトグラフで分析する前にサンプルをろ過する必要があるのですか？
様々な種類の水 (プロセス水、表層水、廃水など) や飲料、抽出液、消化液は、IC システムに悪影響を与える可能性があります。サンプル中の粒子、シルト(沈泥)、植物残渣は、IC システムを汚染するだけでなく、分離カラムの中に蓄積することもあります。粒子の蓄積の結果、カラムの交換容量 (適切なピーク分離に必要) が低下し、システム圧力が急速に増加します。そのため、ピーク分解能が低下し、分離カラムだけでなくガードカラムの寿命も大幅に短くなります。
メトローム インライン限外ろ過
主導ろ過は、よく知られているサンプル前処理ステップです。サンプルはシリンジに吸引され、次に適切なフィルターを通過してろ過されます。これは、時間と高価な消耗品を必要とする人の手間がかかり、多くの場合繰り返しの作業となります。使用済みの消耗品によって大量の廃棄物も発生します。
メトロームのインライン限外ろ過技術は、これらの欠点を完全にインライン化し、自動化したソリューションです。インライン限外ろ過は、最も一般的に使用されているメトロームインラインサンプル前処理技術 (MISP) です。このソリューションにより、ユーザーは限外ろ過膜1枚のみで100以上のサンプルを分析することができます。マトリックスによっては、1枚の限外ろ過膜で最大500または600サンプルをろ過することも可能です。
以下の関連ブログ記事で、限外ろ過膜の交換時期に関する推奨事項をご覧いただけます。
When do I have to exchange the filtration membrane with Inline Ultrafiltration?
技術的には、限外ろ過システムを追加してメトロームICをアップグレードすることができます。唯一の条件は、オートサンプラーにペリスタポンプを装備する必要があることです。次のフローチャートは、限外濾過システムの接続原理を示しています（アニメーション1）。
アニメーション 1. ProfIC Vario 2 アニオンのセットアップと限外ろ過膜セルのアニメーション.
ろ過されていないサンプルをサンプルチェンジャーにセットし、MagIC Netのサンプルリストに入力すれば、あとは何もする必要はありません。オートサンプラーがバイアルからサンプルを吸引し、溶液を限外ろ過膜セルへと導きます（アニメーション1）。
メトローム 限外ろ過セル
限外ろ過セルは、共通のスパイラル フロー パスを持つ 2 つのチャンバーで構成されています。これらのチャンバーは 2 つの個別のペリスタポンプに接続され、膜によって分離されています (アニメーション 1 および 2)。メトローム インライン 限外ろ過のユニークなコンセプトは、サンプルの一部のみが膜表面でろ過されることです (アニメーション 2)。サンプルの大部分は、限外ろ過膜のサンプル側から廃液へ導かれます。サンプル側の流れが連続的になり、粒子がフィルターに付着するのを防ぐことができます。粒子やその他の不要なマトリックス成分は連続的に洗い流されるため、フィルター ケーキは形成されません。クリーンなろ液は、イオンクロマトグラフのサンプル注入用のサンプル ループに導かれます。
アニメーション2. インライン限外ろ過の原理をここに示します。下側では、サンプルはらせん状に巻かれた経路を連続的に流れ、廃液の流れに導かれます。この連続的な流れにより、サンプル側での目詰まりやフィルターケーキの形成が回避され、一方、ろ液は膜（中央）を通過し、注入ループ（上部）に導かれます。サンプルとろ液は異なる速度で送液され、メンブレン表面にダメージを与えることなく圧力差によりろ過プロセスを促進します。
メトロームが提供する標準的な限外ろ過膜（図1）は、孔径0.20 µmの再生セルロース製です。この孔径は、他の膜技術 (手動フィルターの膜や様々なメーカーが提供する専用ろ過キャップなど) よりもはるかに小さいです。0.5µm以上の粒子は、カラム内で閉塞を引き起こす可能性があります。メトロームの膜の孔径は小さいため、0.20 µm以上の粒子が分析システムに入り込んで悪影響を与えたり、ダメージを与えたりすることはありません。
過去数年にわたるセルロース膜材料による限外ろ過システムの性能試験では、溶出による汚染がごくわずかであることが示されており、ユーザーに非常に優れた信頼性を提供している。さらに、セットアップは柔軟で、ラボのニーズに合わせることができます。市販されている他の限外ろ過膜を使用することもできます。ただし、分析を実行する前に、分析の影響や偏りを排除するために、ユーザーによる徹底的なテストが必要となります。
ろ過されたサンプルがICカラムに注入された後、サンプルパス全体（限外ろ過セルを含む）が検出と同時に1つまたは複数の洗浄液で完全に洗浄されます。標準的な洗浄は超純水（UPW）で行われます。必要に応じて、UPWの前に追加のすすぎ液（30％メタノールなど）を使用することで、サンプル経路での細菌の増殖を防ぐことができます。最終すすぎ液には必ずUPWを使用することが重要です。UPWは限外ろ過セルを保存する媒質となるからです。このインライン洗浄ステップにより、インライン限外ろ過はサンプル間のキャリーオーバーを0.1%未満に抑えます。
メトロームインライン限外ろ過は、このシリーズのパート1で紹介しました他のMISP技術と組み合わせることもできます。ICシステムにメトロームのインテリジェントパーシャルループインジェクション技術（MiPT）またはインライン希釈技術を追加することで、検量線の濃度範囲内に収まるように自動的に各サンプルを調製することができます。これらのサンプル前処理技術は、システムの保護、分離カラムの寿命延長、ラボでの大幅な時間短縮、メンテナンスなどのコストを最小限に抑える強力なツールとなります。
メトローム インライン透析
多くの場合、カレッツ沈殿 (塩析法) またはオフライン透析は、高有機負荷のサンプル マトリックスからコロイド、タンパク質、油分などを除去するために使用されます。この種のマトリックスを含むサンプルには、果物や野菜のジュース、牛乳、乳児用調合乳、その他の乳製品が含まれます。従来、脂肪とタンパク質は、カレッツ 試薬 I (ヘキサシアノ鉄酸カリウム (II)) と カレッツ 試薬 II (酢酸亜鉛) を連続して添加することによってサンプルから沈殿されます。沈殿後、溶液を遠心分離してろ過し、透明な上澄み溶液を注入して IC で分析します。この前処理には、いくつかの手動ステップと、かなりの量の化学薬品と機器が必要です。対照的に、メトロームは、このような状況でのサンプル前処理に自動化されたインライン ソリューションを提供します。メトロームインライン透析は、他の時間のかかるサンプル前処理に代わる非常に経済的なソリューションであり、化学薬品を使用する必要がありません。
この技術の中心となるメトローム低容量透析セル（図2）は、セルロースアセテート膜で隔てられた2つのチャンバーで構成され、インライン限外ろ過に使用されるセルと膜のセットアップに似ています。しかし、インライン限外ろ過の原理とは異なり、インライン透析ではストップフロー原理が適用されています。これにより、分析対象物は拡散によって膜表面を通過し、粒子、油脂、大きなタンパク質などの有害なマトリックス成分は排除されます。マトリックスは常に洗い流されるため、膜の汚れは抑制され、圧力がかからないためフィルターケーキの形成も防止されます。
メトローム930と940 ICファミリーは、インライン透析用キットで簡単にアップグレードできます。ただし、ICとオートサンプラーの両方にペリスタポンプを装備する必要があります。標準的なセットアップをアニメーション3に示します。
アニメーション 3. ProfIC Vario 3アニオンシステムを使用したインライン透析の標準セットアップ. サンプル溶液は、サンプルチェンジャーかららせん流路を通って透析セルのサンプルチャンバーに連続的に送り込まれます。サンプルチャンバーは、セルロースアセテート膜によってアクセプターチャンバーから分離されています。後者のチャンバーはアクセプター溶液で満たされています。ストップフロー原理により、イオンのみが拡散によって膜を通過し、アクセプター溶液は平衡に達するまで濃縮されます。その後、アクセプター溶液はICサンプルループに送液され、分析対象物の分離と検出（抑制された導電率の抑制など）のためにカラムに注入される。
生乳サンプルにおけるカレッツ沈殿（塩析法）とメトロームインライン透析の比較
イオンクロマトグラフィーによる生乳サンプル分析のために、2つのサンプル前処理法の効率を比較する徹底的な調査を行いました： インライン透析とカレッツ沈殿 (塩析法) です。全体として、両方のICシステムのセットアップは、約2000回の生乳サンプル注入を行った6ヶ月間の試験期間中、同等の結果をもたらしました。
モニターされたパラメーターの１つはシステム圧力です。圧力が上昇した場合、分離カラムの詰まりや劣化が考えられます。。システム圧力は一連の試験を通して非常に安定していました。品質管理標準物質も決められた間隔で注入し、カラム性能をチェックするためにモニターしました。カラム性能の低下は、ピーク形状の悪化や分離能の低下傾向によって示され、その結果、回収率が標準以下になります。このパラメータは、脂肪、タンパク質、粒子が分離カラムに入り込むと誘発される可能性があります。しかし、一連の試験では、品質管理標準物質（塩化物、硝酸塩、亜硝酸塩）の回収率は、どちらのセットアップでも非常に安定していることが示されました（図3）。
どちらの IC セットアップでも、カラムの寿命にはほとんど影響がありませんでした。しかし、従来の手作業によるサンプル前処理法（Carrez clarification）と自動化されたメトロームインライン透析を徹底的に比較した結果、後者の膜プロセスは、細菌、タンパク質、脂肪、その他の汚染物質から分析システムを適切に保護すると同時に、全体的なラボ作業の労力と化学薬品の使用を最小限に抑える効果があることが証明されました。この研究の詳細は、ホワイトペーパー「メトロームインライン透析による乳製品の簡易分析」をご覧ください。
このように、メトロームのインライン透析は、生乳サンプルのような乳製品にとって理想的なサンプル前処理ツールであることが証明されました。食品サンプルだけでなく、生化学、燃料、製薬など他の産業分野の難しいサンプルにも幅広く適用できます。このコラムの最後に、これらの産業分野での応用例をいくつかご紹介いたします。
結論
この記事で紹介しました膜ベースのインラインサンプル前処理技術（限外ろ過と透析）は、どちらも繰り返しのラボ作業を容易にする強力なツールです。それだけでなく、IC システムを保護しながら、全体的な分析コストと使用する化学薬品の量を削減することにも役立ちます。ただし、サンプルマトリックスは、メトロームインライン限外ろ過 とインライン透析のどちらを選択するかの最終的な判断材料となります。
参考資料
Video: Basics of maintaining and working with ion chromatographs
Application Note: Four anions in a protein formulation using dialysis for sample preparation
ICのための効果的なサンプル前処理について詳しく知る
このモノグラフでは、イオンクロマトグラフィーのサンプル前処理技術について概説し、固相抽出、インライン技術、透析、抽出技術、従来の分解技術、ICのサンプル前処理技術を用いた濃度測定の品質保証対策について詳しく説明しています。
メトロームインライン透析による乳製品の簡易分析
このホワイトペーパーでは、イオンクロマトグラフィー（IC）による生乳サンプルの分析において、自動インライン限外ろ過とインライン透析を従来のカレッツ沈殿 (塩析法) と比較しています。約6ヶ月間にわたる連続試験により、インライン透析はIC分析前の乳製品処理において信頼性が高く、価値ある代替法であることが証明されました。
