ラボのワークフローに NIR 分光法を導入する方法

近赤外分光法（NIRS、NIR Spectroscopy）を分析ワークフローに効果的に組み込むことで、迅速かつ正確な非破壊的ルーチン分析が可能となります。しかし、ラボのワークフローに近赤外分光法を導入するためには、どのようなステップが必要でしょうか？

本シリーズの第3回では、実例を交えて、近赤外分光放(NIR)をラボに導入するために必要な手順をご紹介します。

まず、いくつかの前提条件を設定いたします。

貴社は高分子材料を製造しています。ラボでは迅速な水分測定（カール・フィッシャー滴定法の代替）およ固有粘度測定（粘度計による測定の代替）のためにNIR分光分析装置に投資しました。
例えばNIRS DS2500 アナライザー.のような新しい NIR 分光分析装置が納品されたとします。

Workflow for NIR spectroscopy method implementation.

図 1. NIRスペクトロスコピーメソッド導入のワークフロー

水分の決定や固有粘度の測定は、定量分析の具体例です。NIR分光法は、ほとんどの場合、この分析に即座に使用できません。なぜなら、まずNIRキャリブレーション（または予測モデル）を作成する必要があるからです。

図1に示すように、NIR分光法を実施するためのステップは以下の通りです：

検量線セットの作成
予測モデルの作成と検証
ルーチン分析

このシリーズの第1回 (近赤外分光法 (NIR分光法) とは？)で、既に学んでいるように、NIR分光法は二次的な分析手法です。これは、NIR分析器が主要な手法から得られたパラメータ値に対応する一連のスペクトルを「トレーニング」する必要があることを意味します。水分と固有粘度を分析する場合、主要な手法はカールフィッシャー滴定法と粘度測定法です。この場合、主要な分析からの値は既知となります。

手法が堅牢であるためには、トレーニングセット内のサンプル（校正セットと呼ばれる）が、テストされるパラメータの完全な予想濃度範囲をカバーする必要があります。これは、他の技術（例：高性能液体クロマトグラフ法、HPLCなど）でも同様であり、校正標準曲線が完全な予想濃度範囲をカバーする必要があります。したがって、物質の水分含有量が0.35%から1.5%の範囲にあると予想される場合、校正セット内のサンプルもこの範囲をカバーする必要があります。

NIRS DS2500 アナライザーを使用して、必要なサンプルを測定します。次に、NIR測定から得られた結果を、同じサンプルに対して主要な手法（カールフィッシャー滴定法と粘度測定法）から得られた値と結び付けるためのソフトウェアを利用します。たとえば、Metrohm Vision Air Complete ソフトウェアパッケージを使用して、水分と粘度の値を入力します（図2）。その後、この分光データ（校正セット）を予測モデルの開発に使用します。

図 2. Vision Air Completeには、カールフィッシャー水分測定法と粘度測定法で得られた基準値にリンクされた10回のNIR測定結果が表示されます。

必要なサンプル数またはスペクトル数は？

校正セット内の理想的なスペクトル数は、サンプルの変動（粒子サイズ、化学的分布など）によって異なります。この例では、ポリマーサンプルを10個使用しました。これは、アプリケーションの実現可能性を確認するのに適したスタートポイントです。

しかしながら、すべてのサンプルの変動をカバーし、信頼性の高い定量分析を確実にするためには、より多くのサンプルスペクトルが必要です。一般的には、40〜50のサンプルスペクトルが必要であり、ほとんどの場合に適した予測モデルを得ることができます。

40〜50のスペクトルを含むデータセットは、予測モデルの検証にも用いられます。例えば、Metrohm Vision Air Complete ソフトウェアパッケージを使用して、データセットのサンプルを2つのグループに分割します。

検量線セット 75%
検証用セット 25%

ステップ 2: 予測モデルの作成と検証

予測モデルの作成

校正セットが予想値の範囲全体で測定されたので、予測モデルを作成する必要があります。このステップは、NIRキャリブレーションモデルの開発とも呼ばれます。すべての手順は、Metrohm Vision Air Completeソフトウェアパッケージで完全に開発および実装されていますので心配は無用です。まず、各NIRスペクトルを目視して、濃度が変化すると変化する領域を特定します。多くの場合、数学的な調整（一次または二次微分など）を適用すると、スペクトルの違いがより明確になります（図3）。

図 3. 数学的手法を用いてスペクトル情報を強調した例：a) 数学的最適化なし、b) 2次微分を適用して1920 nmのスペクトル差を強調し、2010 nm付近のピークを増強.

視覚的に特定された後、ソフトウェアはこれらの選択されたスペクトル領域を、主要分析手法から得られた値と相関を見つけます。その結果、相関図が作成されます。相関図には、標準校正誤差（SEC、精度）や相関係数（R2）などの各種の指標が含まれます。図4は、水分に関する相関図の例を示しています。この手順は、この場合は固有粘度などの他のパラメータについても同様に行われます。

図 4. NIR分光法を使用してポリマーサンプルの水分含有量を予測するための相関プロットと性能指数（FOM）。Metrohm Vision Air Completeソフトウェアパッケージの「分割セット」機能により、予測モデルを検証するために使用される検証データセットが生成されます。

単変量と多変量のデータ分析

上記のプロセスは、HPLCの一般的な作業手順に類似しています。HPLCでキ検量線を作成する際、通常はピークの高さまたは面積が既知の標準物質濃度と関連付けられます。ここでは、1つの変数のみが使用されるため（ピークの高さまたは面積）、この手順は「単変量データ解析」として知られています。

一方、NIR分光法は「多変量データ解析」技術です。NIRSは電磁スペクトルの範囲（例えば、水の場合は1900-2000nm）を利用するため、相関関係を作成するために複数の吸光度値が使用されます。

予測モデルの検証

以前と同様に、キャリブレーションセットを使用して予測モデルが作成されますが、予測は検証セットを使用して検証されます。これらのポリマーサンプルの測定結果は、上記の図4に示されています。NIRモデルの作成に未経験で自信がないユーザーは、メトロームのサポートに頼ることができます。私たちは予測モデルの作成と検証をサポートします。

ステップ 3: ルーティン分析

近赤外分光法の優れている点は、予測モデルが作成され、検証された後に明確になります。未知の水分含有量および未知の固有粘度を持つポリマーサンプルを、ボタンを押すだけで分析できるようになります。NIRS DS2500 アナライザーは、これらのパラメータの測定結果を1分未満で表示します。

表示オプション

通常、結果のみが表示されます。時には、測定結果が黄色や赤のボックスで強調表示され、警告やエラーが示されることもあります（図5を参照）。スペクトルは表示されません。

図 5. NIR 分光分析装置を用いて測定された結果の概要.　合格 (ボックスなし) と不合格 (赤いボックス) が表示されます。

もちろん、スペクトルを表示するオプションもありますが、ほとんどのユーザー（特にシフト勤務の従業員）にとって、これらのスペクトルはあまり意味を持たず、何らかの有益な情報を得ることはないでしょう。それよりは、数値データと明確な合格/不合格の表示が重要なものとなります。

また、トレンドチャートの表示も可能であり、生産プロセスを積極的に調整できます。警告およびアクションリミットもここで強調表示されます（図6）。

図 6. NIR水分分析結果のトレンドチャート.　平行線は警告値(黄色)の限界と管理限界値(赤色)を示しています.

まとめ

ラボで NIR を導入するために必要な作業のほとんどは、ワークフローの開始時、つまり全濃度範囲にわたるサンプルの準備と測定時に行われます。予測モデルの作成と検証、および日常的な分析への導入は、Metrohm Vision Air Complete ソフトウェアパッケージを使用して行われ、短期間で完了できます。さらに、サポートが必要な場合は、Metrohm NIRS スペシャリストが予測モデルの作成をサポートします。

この段階で、Metrohmの事前キャリブレーションを使用することで、予測モデルの開発なしにNIR分光法を直接導入できる場合があります。これらは、実際の製品スペクトルに基づく特定のアプリケーション (e.g., viscosity of PET) 用の堅牢で即効性のある操作手順です。

次のコラムでは、それらの特性と利点を紹介します。

NIR spectroscopy pre-calibrations: Immediate results

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