Point-of-Care z Ramanem: Wykrywanie raka, infekcje i nie tylko

Przemysł medyczny jest nową perspektywą dla spektroskopii Raman. W ciągu ostatnich kilku lat Raman został wykorzystany w badaniach stomatologicznych i nowotworowych, a obecnie opiera się na tych osiągnięciach poprzez rozszerzenie aplikacji Point-of-Care (POC). Niniejszy artykuł zawiera przegląd bardzo nowych i ekscytujących badań nad wykorzystaniem spektroskopii Ramana do wykrywania tkanki nowotworowej, biomarkerów chorób i patogenów wywołujących choroby.

Kliknij poniższe łącze, aby przejść bezpośrednio do wybranego tematu:

Wykrywanie chorób kości za pomocą ręcznego spektrometru ramanowskiego
Spektroskopia ramanowska do wykrywania raka
Tradycyjna spektroskopia ramanowska w badaniu raka piersi
SERS do wykrywania i pomiaru biomarkerów raka trzustki
Szybki test Point-of-Care (POC) do wykrywania COVID-19 na poziomie femtograma
Wielokrotne immunofenotypowanie krwi i komórek raka piersi za pomocą spektroskopii Ramana
Łatwe wykrywanie enzymów za pomocą elektrochemicznego efektu SERS

Wykrywanie chorób kości za pomocą ręcznego spektrometru ramanowskiego

Powikłania związane z infekcjami stanowią poważny problem w przypadku stosowania ludzkich przeszczepów kostnych w chirurgii układu mięśniowo-szkieletowego. Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus aureus są najczęstszymi winowajcami infekcji związanych z kośćmi, a leczenie tych bakterii jest niezwykle trudne.

Wykrywanie bakterii gronkowca na przeszczepionym materiale i rozróżnienie między zdrową a chorą kością ma kluczowe znaczenie w zapobieganiu infekcji. Hodowla laboratoryjna tradycyjnie wymaga 7-10 dni na uzyskanie wyników i wiąże się z ryzykiem zanieczyszczenia podczas transportu i testowania. W pozytywnych przypadkach pacjent musi być leczony z mocą wsteczną dużymi dawkami antybiotyków. Idealnym rozwiązaniem dla tego wyzwania jest analiza na miejscu, która pozwala zespołowi chirurgicznemu zidentyfikować i uniknąć chorej kości na miejscu.

Niedawno grupa badawcza z Austrii wykazała skuteczne rozróżnienie między zdrowymi i zakażonymi próbkami kości oraz między dwoma rodzajami bakterii gronkowca za pomocą ręcznego spektrometru ramanowskiego MIRA [1]. Ich procedura analizowała pasma Ramana odcisków palców fosforanów, amidów i kolagenów oraz ich różne intensywności i stosunki szerokości pików w celu rozróżnienia zdrowej i chorej kości. Analiza składowych głównych (PCA) wspierała analizę optyczną i została wykorzystana do dokładniejszego rozróżnienia szczepów gronkowców.

Austriacka grupa doceniła fakt, że MIRA jest "lekka, kompaktowa i zasilana bateryjnie" oraz że spektroskopia Ramana ma tę zaletę, że "minimalizuje przygotowanie próbki i zapewnia szybkie wyniki". Testowanie wymagało jedynie niewielkiej próbki kości do badania na miejscu podczas operacji i pozwoliło uzyskać szybkie i dokładne wyniki bezpośrednio na sali operacyjnej.

Spektroskopia ramanowska do wykrywania raka

Widma "molekularnego odcisku palca" Ramana mogą być wystarczająco czułe, aby wykryć zmiany chemiczne towarzyszące chorobie. Kompaktowe spektrometry Ramana mogą pomóc chirurgom w ocenie guzów podczas zabiegów chirurgicznych w celu szybszego podejmowania decyzji. Przykłady zastosowań dla raka piersi i raka trzustki omówiono w kolejnych punktach.

Tradycyjna spektroskopia ramanowska w ocenie raka piersi

W przypadku podejrzenia raka piersi zwykle konieczna jest operacja w celu wykonania biopsji, oraz kolejna w celu usunięcia złośliwych guzów. Możliwość oceny podejrzanych tkanek podczas wstępnej operacji pozwala na ich natychmiastowe usunięcie, jeśli jest to konieczne. Korzyści dla pacjenta i przemysłu medycznego są nieocenione - a badania sugerują, że spektroskopia ramanowska może być w stanie zaspokoić tę potrzebę w przypadku niektórych rodzajów raka.

Spektroskopia ramanowska jest wystarczająco czuła, aby wykryć zmiany w tkance, które wynikają z wielu rodzajów raka. Na przykład, istnieją bardzo subtelne różnice w widmach Ramana zdrowej tkanki piersi i nowotworów złośliwych. Naukowcy z Wielkiej Brytanii wykorzystali urządzenie laboratoryjne i-Raman o wysokiej rozdzielczości (rysunek 1) oraz narzędzia wielowymiarowe, w tym PCA, do skutecznego rozróżnienia tkanek zdrowych i nowotworowych [2].

Rysunek 1. Przenośny spektrometr ramanowski i-Raman Prime 785S firmy Metrohm.

SERS do wykrywania i pomiaru biomarkerów raka trzustki

SERS (powierzchniowo wzmocniona spektroskopia Ramana) może być rozwiązaniem, gdy Raman nie jest optymalną metodą analizy. Może to mieć miejsce w sytuacjach, gdy cel znajduje się w złożonej matrycy próbki lub z powodu fluorescencji cząsteczek opartych na węglu. SERS wzmacnia sygnał Ramana, ale nie zwiększa poziomu sygnału fluorescencji. Ponadto efekt SERS umożliwia czułe wykrywanie analitów na poziomie mg/l - czasami nawet do µg/l. Wreszcie, piki SERS są ostre i dobrze zdefiniowane, umożliwiając skuteczne wykrywanie i identyfikację docelowych analitów.

Aby dowiedzieć się więcej o SERS, przeczytaj nasz poprzedni wpis na ten temat.

Raman vs SERS… Jakie są różnice?

Rak trzustki jest śmiertelny, częściowo dlatego, że trudno go zdiagnozować. Istnieją jednak pewne biomarkery, które są obecne na podwyższonym poziomie w ~75% pozytywnych przypadków [3]. Można je wykryć za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA), które mierzą różne biomarkery, w tym przeciwciała, antygeny i białka.

W nowej technice, spektrometr laboratoryjny i-Raman został wykorzystany na Uniwersytecie w Utah do analizy SERS w połączeniu z testem ELISA w celu wykrycia antygenu związanego z rakiem trzustki [2]. Sygnał SERS został wygenerowany z cząsteczki reporterowej skompleksowanej zarówno z nanocząsteczką złota, jak i docelowym analitem w klasycznym teście immunologicznym z przepływem bocznym lub "kanapkowym" (rysunek 2). Jest to niezwykle dokładna technika, umożliwiająca bardzo czułe wykrywanie - z możliwością kwantyfikacji - biomarkera będącego przedmiotem zainteresowania.

Rysunek 2. Wykrywanie antygenu związanego z rakiem trzustki jest możliwe dzięki powierzchniowo wzmocnionej spektroskopii ramanowskiej (SERS).

Szybki test Point-of-Care (POC) do wykrywania COVID-19 na poziomie femtograma

MIRA XTR, a handheld Raman spectrometer from Metrohm.

Rysunek 3. MIRA XTR, ręczny spektrometr ramanowski firmy Metrohm.

Alternatywny format testu ELISA został wykorzystany przez naukowców z University of Wyoming do wykrywania biomarkerów antygenowych związanych z zakażeniem COVID-19 [4]. W badaniu tym zastosowano test oparty na nanocząstkach magnetycznych w celu skoncentrowania docelowego biomarkera w roztworze do późniejszego wykrywania SERS za pomocą MIRA XTR (rysunek 3). Okazał się on bardziej czuły niż komercyjne testy z przepływem bocznym, był kompatybilny zarówno z próbkami rozpuszczalnika, jak i śliny, można go było dostosować do nowych wariantów wirusa i osiągnąć wysoce czułą diagnostykę POC COVID-19.

Testy immunologiczne z przepływem bocznym zapewniają stosunkowo szybkie wyniki, ale wykrywalność jest na poziomie nanogramów i mają ograniczenia ilościowe. Dla porównania, test ELISA oparty na SERS jest czuły na femtogramowe ilości antygenu, z szybkimi wynikami w POC za pomocą komercyjnego ręcznego instrumentu Raman.

Wielokrotne immunofenotypowanie krwi i komórek raka piersi za pomocą spektroskopii Ramana

W innym badaniu wykorzystano MIRA DS do oceny przenośnego testu ELISA opartego na SERS do immunofenotypowania różnych typów czerwonych krwinek i powierzchni komórek raka piersi [5]. Rozróżnianie zdrowych i chorych komórek oraz wykrywanie wielu biotargetów w jednej próbce może pomóc w świadomym leczeniu różnych rodzajów raka piersi.

Test ten charakteryzował się "specyficznością, czułością i powtarzalnością dla... immunofenotypowania w różnych typach komórek [przy użyciu] mniejszej objętości próbki analitycznej w porównaniu do konwencjonalnych... multipleksowych testów immunologicznych" i był mniej "pracochłonny i technicznie prosty do wykonania". Autorzy pochwalili Orbital Raster Scan firmy MIRA za poprawę czułości ich testu dzięki większemu obszarowi badania i przestrzennie uśrednionym pomiarom.

Tradycyjne multipleksowe testy przepływowe mogą być ograniczone dostępnością różnych kolorowych barwników i interpretacją wyników. Są one również związane z dużą powierzchnią laboratoryjną. W przeciwieństwie do tego, ta metoda oparta na ręcznej spektroskopii Ramana oferuje potencjał dokładnych wyników POC z krótkim czasem od pobrania próbki do uzyskania wyniku, możliwością multipleksowania i bardzo kompaktowym przyrządem.

Łatwe wykrywanie enzymów za pomocą elektrochemicznego efektu SERS

Figure 4. The SPELECRAMAN638 instrument from Metrohm performs spectroelectrochemical Raman measurements using a 638 nm laser.

Zupełnie inna technika SERS do charakteryzowania cząsteczek biologicznych została opisana przez Metrohm [6]. Technika elektrochemiczna SERS (EC-SERS) umożliwia dwa eksperymenty jednocześnie: proces elektrochemicznej aktywacji cech SERS elektrod srebrnych (Ag SPE), a następnie spektroskopową detekcję próbki (z SPELECRAMAN638, rysunek 4).

W tym przypadku podłoże SERS jest generowane in situ z elektrod srebrnych (zarówno sitodrukowanych, jak i konwencjonalnych). Odbywa się to w obecności analitu podczas stałego badania za pomocą Ramana, aby zoptymalizować wykrywanie związków aktywnych SERS. Wzbudzenie 638 nm zapewnia efekt SERS o dobrej intensywności, przy mniejszym ryzyku uszkodzenia próbki i fluorescencji.

Określenie struktury enzymów (i ich roli w chorobach), takich jak dehydrogenaza aldehydowa (ALDH), pomaga zrozumieć choroby. Dzięki EC-SERS naukowcy zajmujący się aplikacjami zdefiniowali wcześniej nieraportowane pasma Ramana odcisków palców ALDH w roztworze. Podobnie, stany redoks cytochromu c dostarczają informacji o transporcie elektronów przez błony komórkowe [7]. Cytochrom c zmienia stan utlenienia i konformacji podczas eksperymentu EC, a te stany redoks posiadają rozróżnialne widma SERS.

Podsumowanie

Technologia Raman jest obecnie wykorzystywana w innowacyjny sposób. Grupy badawcze na całym świecie stosują jej istotne zalety - w tym czułość, wykrywanie śladów, niewielkie rozmiary i szybkie wyniki - do wykrywania tkanki nowotworowej, biomarkerów chorób i patogenów chorobotwórczych. Odkrycia są niezwykle ekscytujące i obiecujące!

[1] Lindtner, R. A.; Wurm, A.; Pirchner, E.; et al. Enhancing Bone Infection Diagnosis with Raman Handheld Spectroscopy: Pathogen Discrimination and Diagnostic Potential. IJMS 2023, 25 (1), 541. DOI:10.3390/ijms25010541

[2] Thomas, R.; Bakeev, K.; Claybourn, M.; Chimenti, R. The Use of Raman Spectroscopy in Cancer Diagnostics. Spectroscopy 2013, 28 (9), 36–43.

[3] Goonetilleke, K. S.; Siriwardena, A. K. Systematic Review of Carbohydrate Antigen (CA 19-9) as a Biochemical Marker in the Diagnosis of Pancreatic Cancer. Eur J Surg Oncol 2007, 33 (3), 266–270. DOI:10.1016/j.ejso.2006.10.004

[4] Antoine, D.; Mohammadi, M.; Vitt, M.; et al. Rapid, Point-of-Care ScFv-SERS Assay for Femtogram Level Detection of SARS-CoV-2. ACS Sens. 2022, 7 (3), 866–873. DOI:10.1021/acssensors.1c02664

[5] Wang, J.; Koo, K. M.; Trau, M. Tetraplex Immunophenotyping of Cell Surface Proteomes via Synthesized Plasmonic Nanotags and Portable Raman Spectroscopy. Anal. Chem. 2022, 94 (43), 14906–14916. DOI:10.1021/acs.analchem.2c02262

[6] Metrohm AG. Easy Detection of Enzymes with the Electrochemical-SERS Effect; AN-RA-008; Metrohm AG: Herisau, Switzerland, 2023.

[7] Brazhe, N. A.; Evlyukhin, A. B.; Goodilin, E. A.; et al. Probing Cytochrome c in Living Mitochondria with Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Sci Rep 2015, 5 (1), 13793. DOI:10.1038/srep13793

Wiedza, którą możesz wykorzystać

Application Note: Zastosowanie spektroskopii ramanowskiej w diagnostyce nowotworów

Application Note: Łatwe wykrywanie enzymów za pomocą elektrochemicznego efektu SERS - Aktywacja ulepszonych cech elektrod srebrnych pomaga uzyskać charakterystyczne pasma Ramana cząsteczek biologicznych

Blog: Często zadawane pytania (FAQ) dotyczące spektroskopii Ramana: Teoria i zastosowanie

Blog: Często zadawane pytania (FAQ) dotyczące spektroskopii Ramana: Zastosowania

Blog: Podręczne aplikacje Raman 785 nm: Najnowocześniejsze możliwości identyfikacji materiałów w kieszeni

Blog: Spektroelektrochemia Ramana od Indii po Hiszpanię: Historia i zastosowania

Powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie ramanowskie (SERS) - rozszerzenie granic konwencjonalnej analizy ramanowskiej

SERS (Surface-Enhanced Raman Scattering) to anomalne wzmocnienie rozpraszania Ramana, gdy cząsteczki są adsorbowane na nanocząsteczkach złota lub srebra - to wzmocnienie może być tak duże, jak 1e+7. Zaletą SERS dla chemika analitycznego jest jego zdolność do wykrywania stężeń analitu w mg/L (ppm), a nawet µg/L (ppb), podczas gdy klasyczny Raman jest ograniczony do g/L (ppt). Metrohm Raman tworzy testy P-SERS w postaci nanocząstek drukowanych na podłożach przy użyciu technologii atramentowej. Metoda ta pozwala uzyskać niedrogie paski testowe, które wykazują wyjątkową stabilność i czułość. Istnieją dwa obszary rynku, na których można łatwo zastosować P-SERS: analiza kryminalistyczna i bezpieczeństwo żywności. Niniejsza biała księga wyjaśnia mechanizm SERS i sposób, w jaki można go zastosować do ręcznej analizy ramanowskiej za pomocą systemów Metrohm Raman MIRA.

Author

Dr. Melissa Gelwicks

Marketing Specialist
Metrohm Raman (a division of Metrohm Spectro), Laramie, Wyoming (USA)