Análise de prebióticos com IC-PAD: Melhorando AOAC 2001.02

Nossa dieta é fundamental para nossa saúde. Nos últimos anos, o interesse aumentou em aditivos alimentares e suplementos dietéticos, como prebióticos como β-galacto-oligossacarídeos (GOSs). A determinação do teor total de GOS em alimentos e suplementos é essencial para cumprir requisitos rigorosos de rotulagem e segurança de alimentos. O método mais utilizado para determinação total de GOS baseia-se na hidrólise enzimática para quebrar as moléculas complexas em carboidratos simples antes da sua análise cromatográfica. Este artigo descreve a vantagem de usar uma melhoria para Método AOAC 2001.02 usando cromatografia iônica com detecção amperométrica (IC-PAD) e automação completa da amostra após hidrólise enzimática.

O que são GOS?

GOSs são cadeias de unidades de galactose com uma extremidade opcional de glicose. Muitas vezes estão naturalmente presentes em pequenas quantidades em vários alimentos e bebidas.

Inicialmente descobertos como constituintes principais do leite materno humano (presentes até 12 g/L), os GOS são adicionados como suplemento prebiótico às fórmulas infantis. Eles apresentam efeitos bifidogênicos, o que significa que apoiam o crescimento e o bem-estar de bactérias intestinais não patogênicas.

Os suplementos de GOS estão disponíveis crus ou como pós ou xaropes concentrados e são posteriormente utilizados pelos fabricantes de alimentos para enriquecer produtos de consumo ou vendidos como suplementos.

Requisitos de rotulagem GOS

O crescimento contínuo dos mercados globais de prebióticos e GOS é resultado da crescente conscientização dos consumidores em relação à alimentação saudável. Da mesma forma, o aumento da procura relativamente à qualidade dos alimentos levou a regras mais rigorosas e mais abrangentes para a rotulagem e segurança dos alimentos (por exemplo, UE 1169/2011 e UE 2015/2283 ). A determinação do teor total de GOS em alimentos, suplementos ou produtos crus é, portanto, essencial para cumprir tais requisitos.

Estudos sobre os efeitos do GOS na saúde recomendam doses máximas inferiores a 30 g por dia, embora isto seja muito mais rigoroso para fórmulas infantis. Caso contrário, não existem outros limites relativamente ao teor de GOS nos alimentos ou como suplementos nutricionais.

Figure 1. Esquema para determinação do conteúdo total de GOS usando cromatografia iônica com detecção amperométrica pulsada (IC-PAD) de acordo com AOAC 2001.02, e um método otimizado da Metrohm (em verde). A cromatografia para ânions em AOAC é referida como HPAEC (cromatografia de troca aniônica de alto desempenho), mas é simplificada aqui para o termo genérico de IC.

AOAC 2001.02

O método mais utilizado para medir o GOS total em produtos alimentares é o método padrão AOAC 2001.02. Este método baseia-se na extração de GOS de uma amostra seguida de hidrólise enzimática dos oligossacarídeos em monossacarídeos e suas subsequentes análises com cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção amperométrica pulsada.

Na AOAC, a cromatografia para ânions é referida como HPAEC (cromatografia de troca aniônica de alto desempenho), mas aqui vamos simplificar isso para o termo genérico de CI.

A chave para AOAC 2001.02 é a comparação de uma solução controle com outra que foi tratada e hidrolisada com uma enzima (β-galactosidase). A enzima catalisa a quebra de ligações glicosídicas e hidrolisa GOSs e lactose em glicose e galactose. As diferenças de concentração de galactose livre e lactose determinadas nessas duas soluções são usadas para calcular o GOS total (figura 1).

Figure 2. Cromatogramas sobrepostos de Bimuno (suplemento prebiótico), não tratado (preto) e tratado com enzima (laranja).

Melhorias no Método AOAC

A preparação da amostra para AOAC 2001.02 é bastante complexa: uma deficiência é a incubação da solução de referência com a enzima desativada (que é bastante cara) para determinar as concentrações iniciais de carboidratos (figura 1) em vez de usar o extrato puro. Outro ponto crítico é o procedimento de diluição da amostra, que deve ser feito em acetonitrila, enquanto os padrões são baseados em água ultrapura.

Aqui, o foco foi simplificar todo o procedimento para aumentar a facilidade de uso e a eficiência geral do método.

O método melhorado para análise do conteúdo total de GOS utiliza o extrato para medir as concentrações iniciais de glicose, galactose e lactose.figura 1 Ensaio 1). No entanto, a enzima desativada não foi utilizada e, em vez disso, foram feitas comparações para verificar se a sua presença teve algum efeito nos resultados. Esta etapa foi eliminada após comprovação de resultados equivalentes ao AOAC 2001.02 Ensaio 1 (com a enzima desativada), mas despesas com produtos químicos e trabalho manual adicional são reduzidos. O conteúdo total de GOS é, portanto, calculado a partir das concentrações do analito no Ensaio 1 (sem qualquer enzima) e no Ensaio 2 (extrato com a enzima ativa) (Figura 2).

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Rótulos de qualidade para novos alimentos – Melhoria na AOAC 2001.02: Análise GOS com IC-PAD

Além do uso de enzimas, o método oficial da AOAC para análise de GOSs totais sugere que os padrões sejam preparados em água ultrapura (UPW), enquanto as amostras devem ser diluídas com 20% de acetonitrila. Um experimento de controle foi realizado para comparar os resultados entre:

Diluições em UPW avaliado com UPW calibração (“opção UPW”)
Diluições em acetonitrila avaliado com UPW calibração (AOAC 2001.02)
Diluições em acetonitrila avaliado com acetonitrila calibração (“opção ACN”)

A reprodutibilidade do conteúdo total do GOS foi comparada entre as três opções, com o Opções de preparação UPW e AOAC exibindo resultados semelhantes. A opção ACN resultou em menor conteúdo total de GOS do que os outros. Além disso, o acetonitrilo não pareceu conferir um efeito estabilizador ao amostras. Isto apoia a melhoria da AOAC método por realizando diluições de amostra com UPW em vez de acetonitrila, economizando reagentes desnecessários e limitando a impressão química da análise.

Resultados

No geral, a variabilidade satisfatória, as recuperações de alvos e picos, juntamente com os testes de interferência, provaram que o método modificado é adequado. valioso e robusto. Com limites de detecção (LODs) de 0,1 mg/L (galactose) e 0,2 mg/L (glicose, lactose) em solução, mesmo baixos teores totais de GOS podem ser determinados com alta precisão.

Resumo

Como método multicomponente, a cromatografia iônica com detecção amperométrica é um método de análise muito seletivo, sensível e robusto para carboidratos, sem quaisquer etapas adicionais de derivatização. Em combinação com o tratamento enzimático, podem ser quantificados hidratos de carbono ainda mais complexos.

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Esta pesquisa apresenta uma atualização do método padrão AOAC para determinação de GOS total em alimentos. Com o mesmo princípio (hidrólise enzimática de moléculas complexas de GOS seguida de análise cromatográfica de carboidratos simples), a eficiência do método analítico foi melhorada em favor do tempo de laboratório e dos custos de funcionamento. Etapas adicionais de automação (por exemplo, Diluição em linha Metrohm e calibrações automáticas) pode melhorar ainda mais a eficiência do método.

Quer mais informações sobre o método simplificado para GOSs totais via IC-PAD? Mais detalhes sobre o aprimoramento do método AOAC 2001.02 por reduzindo o trabalho manual de laboratório e eliminando reagentes caros pode ser encontrado em nosso artigo publicado em A coluna de LC/GC (2021): Melhorando a AOAC 2001.02: Determinação de GOS em Alimentos Usando HPAEC – PAD.