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Monitorando e mantendo o desempenho da coluna
Um dos requisitos básicos para garantir análises cromatográficas confiáveis é uma coluna de separação de alto desempenho. Os usuários de cromatografia iônica (CI) devem verificar regularmente o desempenho de sua coluna. Desta forma, se uma queda no desempenho se tornar aparente, podem ser tomadas medidas com tempo suficiente para restaurar ou manter o funcionamento adequado da coluna, reduzindo os tempos de inatividade no rendimento da amostra. Nesta postagem do blog, explicamos como você pode avaliar o desempenho da coluna, quais parâmetros você deve monitorar e quais medidas você pode tomar para garantir um excelente desempenho da coluna.
Uso pela primeira vez de uma nova coluna de separação
Ao usar uma coluna pela primeira vez, recomendamos que você verifique seu desempenho inicial. O Certificado de Análise (CoA), que você recebe em cada compra de uma coluna Metrohm, é sua fonte de referência aqui. Registre um cromatograma e use as condições de análise especificadas no CoA: estas incluem quociente de vazão, temperatura, eluente (fase móvel), concentração do analito, amostra tamanho do laço, e supressão.
Você pode avaliar o desempenho da coluna comparando alguns dos parâmetros do resultado com os valores listados no CoA (por exemplo, tempo de retenção, placas teóricas, assimetria, resolução e altura do pico).
Monitoramento regular do desempenho da coluna
As colunas que já estão em uso também devem ser monitoradas regularmente! Recomendamos a realização destes testes com padrões de verificação nas condições de aplicação que você normalmente utiliza, pois o desempenho varia dependendo do tipo de análise e associado condições de análise assim como o configuração instrumental. Se for observada uma redução no desempenho, os requisitos da aplicação são cruciais para determinar se ela ainda pode ser usada.
Abaixo, explicamos como determinar o desempenho da sua coluna com base em cinco indicadores de desempenho. Você também descobrirá como evitar ou corrigir uma queda no desempenho.
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Contrapressão
Monitore a contrapressão: Ao usar sua nova coluna pela primeira vez, salve o valor da contrapressão nas condições de análise de sua aplicação como referência («variável comum» em Rede MagIC). Em seguida, use os resultados definidos pelo usuário para monitorar a diferença entre a contrapressão inicial e aquela exibida durante a determinação atual.
Se você identificar um aumento na contrapressão em comparação com o valor inicial salvo, isso indica que partículas foram depositadas na coluna de guarda ou na coluna de separação. Se o aumento medido for superior a 1 MPa, medidas devem ser tomadas. Primeiro, você deve verificar qual das colunas é afetada (proteção vs. separação). Se a coluna de proteção estiver contaminada, ela deverá ser substituída, pois esta é sua função principal. Se a coluna de separação for afetada, remova-a do sistema, vire-a e reinstale-a e depois lave-a durante várias horas nesta direção de fluxo invertida. Se isso não ajudar, recomendamos fortemente que você considere substituir a coluna. Isto será essencial se a contrapressão máxima permitida para a coluna for atingida.
Tempo de retenção
Para rastrear alterações no tempo de retenção (que sinalizam uma diminuição no desempenho da coluna), o tempo de retenção do último pico do analito é monitorado no cromatograma. O sulfato, por exemplo, é adequado para isso, pois geralmente elui logo no final dos cromatogramas de ânions padrão. Aqui também trabalhe com uma variável comum no MagIC Net para salvar o valor inicial.
Tempos de retenção instáveis podem ser causados pela introdução de dióxido de carbono do ar ambiente ou por bolhas de ar presentes no eluente. Felizmente, esses problemas podem ser resolvidos facilmente (ver tabela 1).
tabela 1. Prevenir e corrigir perda de desempenho em colunas IC.
| Indicador | Causa | Medidas preventivas e corretivas |
|---|---|---|
| Aumentando a contrapressão | Partículas na coluna de guarda | Substitua a coluna de proteção. |
| Partículas na coluna de separação | Enxágue a coluna de separação na direção reversa do fluxo:
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| Partículas na amostra | Preparação de amostras, por exemplo, remoção de partículas através de ultrafiltração em linha | |
| Tempo de retenção reduzido | Carbonato no eluente | O dióxido de carbono do ar afeta o equilíbrio carbonato/hidrogenocarbonato no eluente. Um eluente carbonato/hidrogenocarbonato enfraquece com o tempo; um eluente hidróxido fortalece.
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| Bolhas de ar no eluente | Bolhas de ar tornam o fluxo do eluente instável. A contrapressão é um indicador de fluxo instável. Deve permanecer estável dentro de uma faixa de ± 0,1 MPa.
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| Perda de capacidade na coluna devido a íons de alta valência | Regenere a coluna conforme o folheto da coluna para remover quaisquer depósitos inorgânicos. | |
| Perda de resolução | Eluente muito antigo ou produzido incorretamente | Os eluentes devem ser preparados recentemente. Certifique-se de que sejam produzidos corretamente e principalmente que o carbonato e o hidrogenocarbonato não sejam confundidos. |
| Efeito adsortivo da contaminação depositada na coluna de guarda | Substitua a coluna de proteção. | |
| Efeito adsortivo da contaminação depositada na coluna de separação | Regenere a coluna conforme o folheto da coluna para remover quaisquer depósitos orgânicos ou inorgânicos. | |
| Perda de placas teóricas | Coluna de proteção contaminada | Substitua a coluna de proteção. |
| Coluna de separação contaminada | Regenere a coluna conforme o folheto da coluna para remover quaisquer depósitos orgânicos ou inorgânicos. | |
| Coluna de separação sobrecarregada | A coluna de separação pode ficar sobrecarregada por fatores como alto teor de sal na matriz da amostra.
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| Volume morto no sistema IC |
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| Assimetria | Volume morto ou contaminação na coluna de proteção | Substitua a coluna de proteção. |
| Coluna de separação contaminada | Regenere a coluna conforme o folheto da coluna para remover quaisquer depósitos orgânicos ou inorgânicos. |
A coluna também pode ter perdido alguma capacidade. Esta perda de capacidade pode ser causada pela presença de íons de alta valência que são difíceis de remover devido à sua forte atração pela fase estacionária. A coluna deve então ser regenerada de acordo com o folheto da coluna para remover qualquer contaminação. Se isso não levar a nenhuma melhoria, considere a substituição da coluna dependendo dos requisitos da aplicação, especialmente no caso de perda progressiva de capacidade.
A perda de capacidade também pode ocorrer se os grupos funcionais estiverem permanentemente separados da fase estacionária. Neste caso, a coluna não pode ser regenerada e deve ser substituída.
Resolução
Monitore a resolução cromatográfica comparando medições de um padrão de verificação predefinido com um valor de referência inicial. Se a resolução for R > 1,5, o sinal é considerado separado da linha de base (veja a ilustração abaixo). Contudo, em casos que envolvem matrizes altamente concentradas e para picos mais amplamente espalhados, o valor da resolução deve ser maior para garantir a separação da linha de base.
Se ocorrer uma perda de resolução, certifique-se primeiro de que não é causada pelo eluente ou pelo sistema IC. Uma vez descartados, é possível que o efeito adsortivo de contaminações na coluna de proteção ou na coluna de separação possa ser o responsável. Uma coluna de proteção contaminada deve ser substituída. Se a causa do problema for a coluna de separação, esta deverá ser regenerada de acordo com o folheto da coluna para livrá-la de qualquer contaminação orgânica ou inorgânica. Se a perda de resolução progredir, a substituição da coluna será inevitável.
Placas teóricas
Salve o número inicial de placas teóricas no MagIC Net como uma variável comum, conforme mencionado anteriormente para outros parâmetros. Normalmente, o último pico de eluição é usado – em cromatogramas de ânions, o sulfato mais uma vez provaria ser um candidato adequado. As placas teóricas também dependem da concentração do analito. Portanto, é ideal monitorar este parâmetro durante verificar padrão medições e não durante medições de amostra. Você pode acompanhar o desenvolvimento de quaisquer alterações no número de placas teóricas através dos resultados definidos pelo usuário no MagIC Net.
Uma diminuição nas placas teóricas pode sugerir volume morto no sistema IC (tabela 1). Um baixo número de pratos teóricos também pode ser observado se a coluna tiver sido sobrecarregada por uma alta concentração de sal na matriz da amostra, por exemplo. Se as placas teóricas diminuírem em mais de 20%, isso indica que o desempenho da coluna está diminuindo. Dependendo dos requisitos da aplicação, poderá ser necessário tomar medidas.
Se a coluna de proteção for o motivo da queda no desempenho, ela deverá ser substituída. Se o problema for com a coluna de separação, recomendamos regenerar a coluna de acordo com o folheto da coluna para eliminar qualquer contaminação orgânica ou inorgânica. Se isso não ajudar, você deve considerar a substituição da coluna, principalmente se for observada uma tendência para placas teóricas mais baixas.
Assimetria
Determine a assimetria inicial dos analitos medindo um padrão de verificação predefinido sob as condições de análise da sua aplicação. Salve-o como uma variável comum e acompanhe os resultados definidos pelo usuário para observar o desenvolvimento da assimetria ao longo do tempo. Os valores máximos aceitáveis para a assimetria variam dependendo do analito. Por exemplo, os picos de cálcio e magnésio apresentam inicialmente valores de assimetria relativamente elevados.
A assimetria é definida como a distância da linha central do pico ao lado descendente do pico (B na figura abaixo) dividido pela distância da linha central do pico ao lado ascendente do pico (A na figura abaixo), onde ambas as distâncias são medidas a 10% da altura do pico. Algumas farmacopeias podem usar outros números – verifique para ter certeza dos requisitos do seu país.
AS >1 significa que um pico tem cauda e AS <1 equivale ao pico fronteiriço. A cromatografia ideal é alcançada com assimetrias de pico tão próximas quanto possível de 1. Como regra geral, o desempenho da coluna é considerado em declínio quando a assimetria é AS >2 ou AS <0,5. Dependendo dos requisitos da aplicação, neste caso devem ser tomadas medidas para melhorar a simetria e permitir uma melhor integração.
A razão para valores elevados de assimetria pode ser devido ao cromatógrafo de íons – devido ao volume morto, por exemplo. Caso contrário, é importante descobrir se a assimetria é causada por problemas na coluna de guarda ou na coluna de separação. Se a coluna de proteção causar assimetria, ela deverá ser substituída. Se for a coluna de separação, ela deverá primeiro ser regenerada de acordo com o folheto da coluna para remover qualquer contaminação orgânica ou inorgânica. Se isso não ajudar, considere substituir a coluna. Se for observada uma tendência para valores de assimetria mais elevados, a substituição é inevitável.
Resumo
Há muitas maneiras de estimar o desempenho do pilar e acompanhar valores concretos ao longo de sua vida útil. A manutenção adequada pode prolongar a vida útil da coluna de separação, bem como utilizar sempre uma coluna de guarda para proteção extra. Para mais informações, confira nossos outros artigos do blog sobre esse assunto!
