Aplicação de métodos validados pela USP para equivalência de colunas de separação

A Farmacopeia dos Estados Unidos (USP) iniciou a atualização de cerca de 4.300 Monografias e 220 Capítulos Gerais com tecnologia moderna em 2010 [1]. Durante esse período, a cromatografia iônica (CI) também se tornou uma técnica analítica mais popular à medida que amadurecia. As agências reguladoras consideram agora o IC uma tecnologia aceitável para analisar produtos farmacêuticos e biofarmacêuticos.

O escopo das análises de IC na indústria farmacêutica é bastante amplo. O IC pode avaliar vestígios de impurezas, excipientes, ingredientes farmacêuticos ativos (APIs) e metabólitos, bem como determinar componentes iônicos em soluções farmacêuticas e fluidos corporais [2–10]. Esses parâmetros de controle de qualidade podem ser medidos nas matérias-primas, durante o processo produtivo e nos produtos finais. O IC também é adequado para controle de qualidade de água de processo e águas residuais – protegendo a produção e garantindo que as águas residuais descartadas atendam aos regulamentos [2,11–17].

Este artigo do blog enfoca a incorporação do CI durante a modernização dos métodos da USP. A equivalência de colunas de separação é discutida e como isso torna os laboratórios mais flexíveis ao implementar colunas alternativas para métodos analíticos de acordo com os requisitos da USP.

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Capítulos Gerais e Monografias da USP
Guia USP para validação cromatográfica, qualificação e adequação de sistemas
Especificações e requisitos para análises farmacêuticas de alta qualidade
A coluna analítica: uma parte essencial da metodologia
Critérios de aceitação do método USP para colunas
Estudos bem-sucedidos de equivalência de colunas pela Metrohm
A importância da equivalência de colunas para análises farmacêuticas

Capítulos Gerais e Monografias da USP

A USP fornece padrões de qualidade para medicamentos seguros, substâncias farmacêuticas, suplementos dietéticos e produtos alimentícios. As premissas e definições básicas estão resumidas nos capítulos «Avisos e Requisitos Gerais». «Monografias» e «Capítulos Gerais» descrevem procedimentos de teste e critérios de aceitação ou orientações gerais para garantir a identidade, qualidade e pureza dos produtos.

Guia USP para validação cromatográfica, qualificação e adequação de sistemas

Capítulo Geral <621> [18] (assim como <1065> [19] e <1225> [20]) concentra-se na validação e qualificação de métodos cromatográficos, incluindo IC. Também define os requisitos e a estrutura para testes de adequação do sistema.

Os testes de adequação do sistema são parte integrante do procedimento analítico. Esses testes garantem o desempenho adequado do sistema cromatográfico. O cumprimento dos critérios de adequação do sistema é obrigatório durante todo o procedimento cromatográfico. Uma análise de amostra só é aceitável se a adequação do sistema tiver sido demonstrada.

Especificações e requisitos para análises farmacêuticas de alta qualidade

O processo geral de validação e qualificação de um método USP para determinação dos analitos descritos nas Monografias e Capítulos Gerais é muito complexo e está sujeito a diretrizes rígidas como já mencionado.

Os procedimentos cromatográficos gerais especificados nestes métodos USP envolvem numerosos detalhes sobre o sistema e as condições cromatográficas. Para estas condições, os testes de adequação do sistema mostram que o método cromatográfico é robusto e válido para quantificar os analitos de interesse. Esses testes incluem amostras repetidas e medições padrão que devem atender aos critérios de aceitação, bem como cumprir os critérios de desempenho do método [18,21] conforme explicado abaixo:

número de placas teóricas (N, uma medida para a eficiência da coluna)
fator de cauda (também chamado de fator de simetria A_S, uma medida para assimetria de pico)
resolução (R_S, descreve a qualidade da separação)
desvio padrão relativo – uma medida da repetibilidade do sistema calculada a partir de séries consecutivas de medições para não menos que três, mas até seis injeções ou aplicações de uma solução de referência

Programas de software cromatográficos modernos (por exemplo, MagIC Net) facilitam o procedimento geral de cálculo destes parâmetros. Contudo, o procedimento de validação completo é rigoroso, trabalhoso e muito complexo.

A coluna analítica: uma parte essencial da metodologia

Considerando os parâmetros metodológicos, fica evidente que a coluna é parte fundamental do método. Isso é especificado pelas dimensões e pelo empacotamento da coluna (ou classificação do grupo L conforme o banco de dados da USP).

tabela 1 lista alguns grupos L relevantes para a análise de IC juntamente com sua descrição e exemplos de colunas Metrohm equivalentes. Eles são encontrados no banco de dados de colunas da USP [22] e também estão especificados no capítulo «Reagentes» dos documentos da USP [23].

Tabela 1. Grupos L de empacotamento de coluna USP, definições, colunas de separação compatíveis da Metrohm e monografias da USP quando aplicáveis.

Embalagem	Descrição	Coluna Metrohm compatível	Monografia(s) USP
L46	Substrato de poliestireno/divinilbenzeno aglomerado com esferas de látex funcionalizadas com amina quaternária (diâmetro 9–11 µm).	Metrosep A Supp 1 - 250/4.6	Voriconazol, solução tópica de fluoreto de sódio e fosfato acidulado, solução oral de fluoreto de sódio, <345> ensaio para ácido cítrico/citrato e fosfato
L76	Material de troca catiônica fraca à base de sílica, com 5 µm de diâmetro. O substrato é ácido polibutadieno-maleico polimerizado na superfície para fornecer funcionalidades de ácido carboxílico. Capacidade não inferior a 29 µEq/coluna.	Metrosep C 4 - 250/4.0 Metrosep C 6 - 150/4.0	Cápsulas de acetato de cálcio, citrato de potássio e solução oral de ácido cítrico, comprimidos efervescentes de bicarbonato de potássio para solução oral, bicarbonatos de potássio e sódio e comprimidos efervescentes de ácido cítrico para solução oral, comprimidos efervescentes de bicarbonato de potássio e cloreto de potássio para solução oral (potássio)
L91	Resina forte de troca aniônica que consiste em esferas porosas monodispersas de poliestireno/divinil benzeno (diâmetro 3–10 µm) acopladas com amina quaternária.	Metrosep A Supp 10 - 250/4.0 Metrosep A Supp 16 - 100/4.0 Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 Metrosep A Supp 19 - 150/4.0	Óxido de zinco, óxido de zinco neutro, óxido de zinco em pó, solução oftálmica de sulfato de zinco, <591> Determinação de zinco, fluoreto de sódio, gel de fluoreto de sódio, solução oral de fluoreto de sódio, comprimidos efervescentes de bicarbonato de potássio e cloreto de potássio para solução oral, comprimidos de fluoreto de sódio, estanoso Fluoreto, Monofluorofosfato de Sódio, Gel de Fluoreto Estanoso, Injeção Composta de Fosfatos de Potássio, Comprimidos de Cloreto de Sódio para Solução, Injeção Composta de Fosfatos de Sódio
L97	Resina fraca de troca catiônica que consiste em um núcleo altamente reticulado de partículas porosas de 5,5 µm com um tamanho de poro de 2.000 Å e consistindo de etilvinilbenzeno reticulado com 55% de divinilbenzeno. O substrato é enxertado na superfície com grupos funcionalizados com ácido carboxílico. Capacidade não inferior a 2.400 µEq/coluna (4 mm x 25 cm).	Metrosep C Supp 2 - 250/4.0	Injeção composta de bicarbonato de sódio, injeção composta de fosfato de sódio
L105	Uma forte resina de troca aniônica que consiste em partículas supermacroporosas (2.000 Å) de 9 µm altamente reticuladas funcionalizadas com látex de reticulação muito baixa (0,2%) para fornecer locais de íons alquilamônio quaternário.	Metrosep A Supp 4 - 250/4.0	Nitrito de sódio

Critérios de aceitação do método USP para colunas

Primeiro, a coluna deve ser atribuída a uma categoria L específica. Os materiais para cada grupo L ou categoria têm certas propriedades e fisioquímica da coluna (ver tabela 1 por exemplo). Eles precisam corresponder às propriedades e à química da coluna de separação em questão. As categorias do grupo L podem incluir colunas diferentes de um único fornecedor ou de diferentes fabricantes.

Se a USP atribuir uma coluna individual a um grupo L, então as condições descritas em uma Monografia poderão ser qualificadas (por exemplo, determinação de óxido de zinco de acordo com USP <591> [24]; AN-U-076) conforme descrito anteriormente. O grupo L é especificado para cada método IC—não é uma coluna específica. Isso permite alguma flexibilidade ao usuário dependendo de sua preferência ao selecionar uma coluna do mesmo grupo L para qualificação de método (tabela 1).

Equivalência de coluna

Equivalência de colunas agora permite que laboratórios e fabricantes qualifiquem colunas para métodos cromatográficos validados. figura 1 mostra o procedimento geral.

Existem duas opções para realizar teste de equivalência de coluna sem a necessidade de uma validação completa:

o usuário seleciona uma coluna que pertence ao mesmo grupo L conforme especificado para o método totalmente validado
o usuário seleciona uma coluna que pertence a um grupo L semelhante em suas características físico-químicas da fase estacionária junto com nenhuma mudança de identidade do substituinte

Capítulo Geral da USP <621> [18] especifica os requisitos para este procedimento juntamente com os critérios de adequação e aceitação do método validado para o qual a coluna precisa ser qualificada.

Figure 1. Esquema ilustrado mostrando como colunas de separação equivalentes são propostas, revisadas, aprovadas e aceitas pela USP.

Estudos bem-sucedidos de equivalência de colunas pela Metrohm

A Metrohm está envolvida na realização de validações completas de métodos USP. Um exemplo é descrito na Nota de Aplicação AN-S-398: «Fosfato em injeções compostas de fosfatos de sódio e potássio». Aqui o Metrosep A Supp 17 - 150/4.0 coluna é usada para a determinação de fosfato.

Várias colunas Metrohm (tabela 1) foram qualificados para métodos USP dentro do processo de equivalência de colunas. Outros exemplos incluem a validação do Metrosep A Supp 4 - 250/4.0 coluna para o ensaio de nitrito em nitrito de sódio (AN-S-400) ou o Metrosep A Supp 1 coluna para quantificação de voriconazol, conforme mostrado com mais detalhes abaixo.

Exemplo de aplicação: análise de voriconazol

O Metrosep A Supp 1 coluna foi qualificada pela USP para análise do composto F relacionado ao voriconazol. Voriconazol é um medicamento usado para tratar infecções fúngicas graves [25]. mesa 2 lista todos os requisitos e parâmetros do método da USP, bem como as características de desempenho alcançadas para o estudo de equivalência de colunas.

O estudo foi realizado com um 940 CI Profissional Vario sistema usando soluções de Composto Relacionado ao Voriconazol F RS. Diferentes concentrações (2,5–5 µg/mL) e composições foram utilizadas para testes de adequação do sistema (Tabela 3). Além disso, uma amostra de solução de voriconazol foi testada (Lote nº: VZFP22009, Tabela 4).

Mesa 2. Requisitos relativos à equivalência de coluna para Composto F relacionado ao voriconazol de acordo com a USP.

Composto F relacionado ao voriconazol de acordo com USP - Tabela de resumo
Parâmetros	Monografia USP	Metrohm
Eluente (fase móvel)	Solução de hidróxido de sódio: 470 g/L de hidróxido de sódio em água Fase móvel: metanol, água e solução de hidróxido de sódio (500:1500:0,175)	Igual à Monografia da USP
Solução estoque de cloreto	86 μg/mL de cloreto de sódio em água	Igual à Monografia da USP
Solução de estoque padrão	250 μg/mL de Composto Relacionado ao Voriconazol USP F RS. Dissolver em 50% do volume final com metanol e diluir com Fase Móvel até volume.	Igual à Monografia da USP
Solução padrão	5,0 μg/mL de Composto Relacionado ao Voriconazol USP F RS da solução estoque padrão em uma mistura de metanol e fase móvel (50:50)	Igual à Monografia da USP
Solução de adequação do sistema A	5 μg/mL de Composto Relacionado ao Voriconazol USP F RS da solução estoque padrão e 1,7 μg/mL de cloreto de sódio em uma mistura de metanol e fase móvel (50:50)	Igual à Monografia da USP
Solução de adequação do sistema B	2,5 μg/mL de Composto F RS relacionado ao voriconazol USP da solução padrão na fase móvel	Igual à Monografia da USP
Solução de amostra	5 mg/mL de voriconazol. Dissolver em 50% do volume final com metanol e diluir com Fase Móvel até volume.	Igual à Monografia da USP
Detecção	Condutividade com supressão	Igual à Monografia da USP: Condutividade com supressão (MSM_ChS)
Coluna	Coluna de guarda de 4 mm x 5 cm e coluna analítica de 4 mm x 25 cm; ambos com embalagem L46	Metrosep A Supp 1 Guarda/4.6 (P/N: 6.1005.340) Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 (P/N: 6.1005.300)
Quociente de vazão	1,0 mL/min	Igual à Monografia da USP
Volume de injeção	20 μL	Igual à Monografia da USP
Tempo de execução	Não mencionado	60 minutos
Temperatura da Coluna	40ºC	Igual à Monografia da USP

O sistema Metrohm IC usando o Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 coluna atendeu aos critérios de adequação da USP para a análise do Composto Relacionado ao Voriconazol F RS (Tabela 3).

Tabela 3. Determinação da adequação do sistema Metrohm IC em comparação com os requisitos da Monografia da USP para a análise do Composto F Relacionado ao Voriconazol (VRC-F).

Adequação do sistema (n=6)	USP Monografia	Metrohm
Fator de cauda (Solução de adequação do sistema B)	NMT 2.0 para pico VRC-F	1.219 (PASSAR)
Desvio padrão relativo (Solução de adequação do sistema B)	NMT 10,0% para íon VRC-F	2,347% (PASSAR)
Resolução entre o íon VRC-F e o íon Cloreto (Solução de adequação do sistema A)	NLT 3.5	11.41 (PASSAR)

Este estudo também atendeu ao critério de aceitação para análises de amostras de voriconazol (Tabela 4) e foi aceito pela USP. Um exemplo de cromatograma do Composto F relacionado ao voriconazol é mostrado em Figura 2.

Tabela 4. Critério de aceitação da USP para análise de voriconazol com cromatografia iônica.

Voriconazol (Lote Nº: VZFP22009)	Monografia USP	Metrohm
Resultados médios da amostra: Preparações de amostras em triplicado (solução de amostra de voriconazol)	NMT 0,1%	0,04% (PASSAR)

Figure 2. Exemplo de cromatograma de um padrão de referência USP para o Composto F relacionado ao voriconazol determinado com a coluna Metrosep A Supp 1.

A importância da equivalência de colunas para análises farmacêuticas

Os sistemas dedicados de cromatografia iônica de laboratório podem diferir das configurações validadas pela USP. Isto se deve principalmente às colunas cromatográficas em uso. A iniciativa de modernização das Monografias da USP ampliou a seleção de colunas para pesquisadores. Isto é altamente benéfico para a indústria farmacêutica.

Os estudos de equivalência de colunas permitem o uso de colunas analíticas alternativas para análises farmacêuticas de alta qualidade. Isto economiza uma quantidade significativa de tempo e esforço, evitando um procedimento completo de validação do método que leva várias semanas. Em última análise, a precisão e a confiabilidade dos resultados analíticos ainda são alcançadas de acordo com o método validado.

A Metrohm oferece diversas aplicações validadas pela USP, bem como colunas alternativas para métodos validados pela USP, aprovados por estudos bem-sucedidos de equivalência de colunas.

[1] A Convenção Farmacopeial dos Estados Unidos. História da Modernização da Monografia. https://www.usp.org/get-involved/partner/monograph-modernization-history (acessado em 13/09/2023).

[2] Kappes, S. Quando a HPLC falha: IC em análises de alimentos, água e farmacêutica. Papel branco, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Suíça 2019.

[3] Kappes, S.; Steinbach, A.; Rute, K. IC: O versátil em análise farmacêutica. Papel branco, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Suíça 2017.

[4] Metrohm AG. Análise Farmacêutica: Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos. Folheto, 8.000.5139PT, Metrohm AG, Herisau, Suíça 2015.

[5] Subramanian, N. H.; Wille, A. Preparação de amostras em linha – uma ferramenta eficaz para análise de íons em produtos farmacêuticos. Metrohm AG, 8.000.6010.

[6] Metrohm AG. Atualize seus métodos USP! - Os benefícios da cromatografia de íons Metrohm para análises de APIs, impurezas e excipientes. Folheto, 8.000.5436PT, Metrohm AG, Herisau, Suíça 2023.

[7] Jenke, D. Aplicação da Cromatografia Iônica em Análise Farmacêutica e de Medicamentos. Jornal de ciência cromatográfica 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[8] Metrohm AG. Controle de qualidade de concentrados de diálise; Nota de aplicação, AN-D-003; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2022.

[9] Metrohm AG. Determinação qualitativa de ânions na urina para verificar adulteração; Nota de aplicação, AN-S-215; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2005.

[10] Metrohm AG. Manitol, Ramnose, Lactulose e Lactose em Soro Sanguíneo com Detecção Amperométrica Pulsada (PAD); Nota de aplicação, AN-P-063; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2016.

[11] Metrohm AG. Métodos padrão em análise de água; Boletim de Aplicação, AB-221; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2015.

[12] Bruttel, A.; Seifert, N.; Laubli, M.; e outros. Monografia: Análise de Amostras de Água e Constituintes de Água com Instrumentos Metrohm, 8.108.5071PT; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2021.

[13] Rute, K. Medição de ácidos orgânicos e ânions inorgânicos com espectrometria de massa por cromatografia iônica. papel branco WP-086EN; Metrohm AG, Herisau, Suíça 2023.

[14] Metrohm AG. Monitoramento de traços em água destilada usando cromatografia iônica; Nota de aplicação, AN-Q-008; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2015.

[15] Gandhi, J.; Pfundstein, P.; Martinho, C.; e outros. Monitoramento de meios de contraste contendo iodo e gadolínio em estações de tratamento de água; Pôster Técnico, 8.000.6085PT; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2012.

[16] Pfundstein, P.; Martinho, C.; Schulz, W.; e outros. Análise IC – ICP-MS de agentes de contraste para ressonância magnética à base de gadolínio (TA-023); LCGC Ásia-Pacífico, 2011.

[17] Metrohm AG. Análise de Águas Residuais em Estações de Tratamento. Folheto, 8.000.5142PT, Metrohm AG, Herisau, Suíça 2015.

[18] VOCÊ. S. Farmacopéia/Formulário Nacional. Capítulo Geral, <621> Cromatografia; USP-NF: Rockville, MD, EUA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[19] VOCÊ. S. Farmacopéia/Formulário Nacional. Capítulo Geral, <1065> Cromatografia de Íons; USP-NF: Rockville, MD, EUA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M897_01_01

[20] VOCÊ. S. Farmacopéia/Formulário Nacional. Capítulo Geral, <1225> Validação dos Procedimentos Compendiais; USP-NF: Rockville, MD, EUA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[21] Schäfer, H.; Laubli, M. Monografia Cromatografia Iônica, 8.108.5077PT; Metrohm AG: Herisau, Suíça, 2023.

[22] VOCÊ. S. Farmacopeia. Colunas Cromatográficas; USP: Rockville, MD, EUA, 2023.

[23] VOCÊ. S. Farmacopéia/Formulário Nacional. Reagentes; USP-NF: Rockville, MD, EUA, 2023.

[24] VOCÊ. S. Farmacopéia/Formulário Nacional. <591> Determinação de Zinco. Em Capítulo Geral; USP/NF, Rockville, MD, EUA; DOI:10.31003/USPNF_M99350_05_01

[25] ASHP. AHFS® Patient Medication Information™: Voriconazol, 2023.