Tris(hydroxymethyl)aminomethan (auch bekannt als TRIS, THAM oder Tromethamin) ist ein häufiger Bestandteil von Pufferlösungen in den Biowissenschaften. Es hat eine hohe Pufferkapazität zwischen pH 7,2–9,0, einen pKA von 8,2 (20 °C) und komplexiert mit Metallionen, was TRIS ideal für biochemische und molekularbiologische Anwendungen macht [1]. TRIS-Puffer werden zur DNA-Reinigung, zur Trennung von Proteinen mit SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) oder zur Trennung von Nukleinsäuren mittels Gelelektrophorese verwendet [2]. TRIS wird auch zur Behandlung einer metabolischen Azidose eingesetzt und kann in seiner nicht-ionisierten Form die Zellmembran durchdringen und fungiert daher als intrazellulärer Puffer [3]. Aus diesen Gründen ist die Kontrolle der Reinheit von TRIS besonders für den Einsatz in der Pharmaindustrie von entscheidender Bedeutung.
Die Kombination einer Metrosep C Supp 2 – 250/4.0-Säule mit einem Methansulfonsäure (MSA)-Eluenten eignet sich als robuste ionenchromatographische (IC) Methode ideal zur Bestimmung von TRIS und anderen kationischen Verunreinigungen. Das Mikrobore-IC-System (MB) ist mit dem IC-Leitfähigkeitsdetektor MB ausgestattet, der sowohl empfindlich als auch stabil gegenüber MSA-Eluenten ist. Dies garantiert ein geringes Totvolumen, Langzeitstabilität des Analysesystems und präzise Ergebnisse bei der TRIS-Quantifizierung.
Die Proben wurden aus Trizma®-Basispulver (TRIS) in PA-Qualität (CAS 77-86-1, gekauft von Sigma Aldrich Nr. 93350) hergestellt. Zur Methodenevaluierung wurden zwei unterschiedliche Konzentrationen von TRIS (10,37 mg/l und 103,7 mg/l) im Eluenten (0,1 % Methansulfonsäure) gelöst.
Der Microbore-Ionenchromatograph 930 Compact IC Flex Oven/DEG/MB wurde mit dem MSA-stabilen IC Conductivity Detector MB (Abbildung 1) ausgestattet. Für diesen nicht suppressierten Aufbau wurde ein Eluent bestehend aus 0,1% (v/v) MSA (15 mmol/L MSA) verwendet (Tabelle 1). Die Proben wurden mithilfe der intelligenten Partial Loop Injektionstechnik (MiPT, Abbildung 2) injiziert. Diese Technik füllt die 250 μL-Probenschleife mit einem genau gemessenen und frei wählbaren Volumen (in dieser Anwendungsstudie von 5 bis 40 μL). Dabei übernimmt ein Dosino mit einer 2-mL-Dosiereinheit die präzise Dosierung. Mittels MiPT wurde eine Kalibrierung in einem Bereich von 5−140 mg/L TRIS mit einem einzigen Standard erstellt.
Die variable Volumenwahl lässt sich auch bei der Probeninjektion anwenden. In solchen Situationen wird beispielsweise für eine hochkonzentrierte Probe ein kleines Injektionsvolumen gewählt und so der manuelle Verdünnungsschritt weggelassen.
Typische anorganische Kationen (z. B. Lithium, Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium) wurden auf die Metrosep C Supp 2-Säule injiziert, um mögliche Coelutionen zu prüfen.
| Säule | Metrosep C Supp 2 - 250/4,0 |
|---|---|
| Eluent/Verdünnungsmittel | c(MSA) = 0,1 % (v/v) |
| Fuss | 1,0 ml/min |
| Temperatur | 30 °C |
| Injektionsvolumen | 5–40 µL (MiPT) |
| Detektion | Direkte Leitfähigkeit |
Die TRIS-Bestimmung erfolgt mittels isokratischer Elution in dem MB IC-System in weniger als 8 Minuten. Die Methode erwies sich hinsichtlich der oben beschriebenen Hauptkationen als störungsfrei.
Natrium hatte eine Retentionszeit von 4,1 Minuten. Durch Ändern der Methodenparameter, z. B. durch Verringern der Säulentemperatur auf 20 °C, wird die Auflösung zwischen Natrium und TRIS verbessert. Mit den verwendeten Methodenparametern (Tabelle 1) ist eine genaue Bestimmung durch Auswertung der Peakhöhe möglich. Die Wiederfindungsraten für 100 mg/l TRIS lagen bei 99–103 % mit einer relativen Standardabweichung von <3 %, was die Genauigkeit dieser Methode verdeutlicht.
In der pharmazeutischen Industrie verwendete Rohstoffe wie Lösungen und Puffer müssen hinsichtlich ihrer exakten Konzentration und Reinheit höchste Qualitätsstandards erfüllen.
Der Aufbau in dieser Anwendungsstudie umfasst ein Microbore-IC-System, einen MSA-stabilen Leitfähigkeitsdetektor und MiPT zur automatischen Kalibrierung mit einem einzigen Standard und flexibler Auswahl der Probeninjektionsvolumina. Die Methode eignet sich zur Quantifizierung von TRIS im Bereich von 5−200 mg/L. Es gewährleistet auf einfache und präzise Weise eine robuste Bestimmung der gängigen Pufferkomponente TRIS.
- Deutscher, M. P. Guide to Protein Purification; Gulf Professional Publishing, 1990.
- Westermeier, R. Electrophoresis in Practice: A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations; John Wiley & Sons, 2016.
- Sirieix, D.; Delayance, S.; Paris, M.; et al. Tris-Hydroxymethyl Aminomethane and Sodium Bicarbonate to Buffer Metabolic Acidosis in an Isolated Heart Model. Am J Respir Crit Care Med 1997, 155 (3), 957–963. https://doi.org/10.1164/ajrccm.155.3.9117032.
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