Anwendung von USP-validierten Methoden für die Äquivalenz von Trennsäulen

Das US-amerikanische Arzneibuch (United States Pharmacopeia, USP) hat 2010 damit begonnen, rund 4300 Monografien und 220 allgemeine Kapitel mit moderner Technologie zu aktualisieren [1]. In dieser Zeit entwickelte sich auch die Ionenchromatographie (IC) zu einer immer beliebter werdenden Analysetechnik. Regulierungsbehörden betrachten IC mittlerweile als akzeptable Technologie zur Analyse von Pharmazeutika und Biopharmazeutika.

Der Anwendungsbereich von IC-Analysen in der Pharmaindustrie ist recht breit gefächert. IC kann Spurenverunreinigungen, Hilfsstoffe, pharmazeutische Wirkstoffe (APIs) und Metaboliten bestimmen sowie ionische Komponenten in pharmazeutischen Lösungen und Körperflüssigkeiten analysieren [2–10]. Diese Qualitätskontrollparameter können in Rohstoffen, während des Produktionsprozesses und in Endprodukten gemessen werden. IC eignet sich auch zur Qualitätskontrolle von Prozesswasser und Abwasser – so wird die Produktion gesichert und sichergestellt, dass das eingeleitete Abwasser den Vorschriften entspricht [2,11–17].

Dieser Blogbeitrag legt den Fokus auf die Rolle der IC bei der Modernisierung der USP-Methoden. Es wird die Äquivalenz von Trennsäulen diskutiert und wie sie Labore flexibler macht, indem sie alternative Säulen für Analysemethoden in Übereinstimmung mit den USP-Anforderungen implementiert.

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Allgemeine Kapitel und Monographien der USP
USP-Leitfaden zur chromatographischen Validierung, Qualifizierung und Systemeignung
Spezifikationen und Anforderungen für hochwertige pharmazeutische Analysen
Die analytische Säule: ein wesentlicher Bestandteil der Methodik
Akzeptanzkriterien der USP-Methode für Säulen
Erfolgreiche Säulenäquivalenzstudien von Metrohm
Die Bedeutung der Säulenäquivalenz für die pharmazeutische Analyse

Allgemeine Kapitel und Monographien der USP

Die USP stellt Qualitätsstandards für sichere Medikamente, pharmazeutische Substanzen, Nahrungsergänzungsmittel und Lebensmittelprodukte bereit. Grundlegende Annahmen und Definitionen sind in den Kapiteln „Allgemeine Hinweise und Anforderungen“ zusammengefasst. Die „Monographien“ und „Allgemeinen Kapitel“ beschreiben Analyseverfahren und Akzeptanzkriterien oder allgemeine Leitlinien zur Sicherstellung der Identität, Qualität und Reinheit von Produkten. 

USP-Leitfaden zur chromatographischen Validierung, Qualifizierung und Systemeignung

Der Schwerpunkt des allgemeinen Kapitels <621> [18] (sowie <1065> [19] und <1225> [20]) liegt auf die Validierung und Qualifizierung chromatographischer Methoden, einschließlich IC. Außerdem werden hier die Anforderungen und der Rahmen für Systemeignungstests festgelegt.

Der Systemeignungstest ist ein integraler Bestandteil des Analyseverfahrens. Dieser Test gewährleistet eine angemessene Leistung des chromatographischen Systems. Die Einhaltung der Systemeignungskriterien ist während des gesamten chromatographischen Verfahrens zwingend erforderlich. Eine Probenanalyse ist nur zulässig, wenn die Eignung des Systems nachgewiesen wurde. 

Spezifikationen und Anforderungen für hochwertige pharmazeutische Analysen

Der gesamte Validierungs- und Qualifizierungsprozess für eine USP-Methode zur Bestimmung der Analyten, die in den Monographien und allgemeinen Kapiteln beschrieben sind, ist sehr komplex und unterliegt, wie bereits erwähnt, strengen Richtlinien. 

Die in diesen USP-Methoden spezifizierten allgemeinen chromatographischen Verfahren beinhalten zahlreiche Details über das chromatographische System und die Bedingungen. Unter diesen Bedingungen zeigen die Systemeignungstests, dass die chromatographische Methode robust und sicher für die Quantifizierung der interessierenden Analyten ist. Solche Tests umfassen wiederholte Proben- und Standardmessungen, die sowohl den Akzeptanzkriterien als auch den Leistungskriterien der Methode entsprechen müssen [18,21] wie im Folgenden erklärt: 

Anzahl der theoretischen Böden (N, ein Maß für die Säuleneffizienz)
Tailing-Faktor (auch Symmetriefaktor genannt). A_S, ein Maß für die Peak-Asymmetrie)
Auflösung (R_S, beschreibt die Trennqualität)
relative Standardabweichung – ein Maß für die Systemwiederholbarkeit, berechnet aus aufeinanderfolgenden Messreihen für mindestens drei, aber bis zu sechs Injektionen oder Anwendungen einer Referenzlösung

Moderne chromatographische Softwareprogramme (z. B. MagIC Net) erleichtern die Gesamtberechnung dieser Parameter. Allerdings ist das gesamte Validierungsverfahren streng, arbeitsaufwendig und sehr komplex.

Die analytische Säule: ein wesentlicher Bestandteil der Methodik

Betrachtet man die methodischen Parameter, so wird deutlich, dass die Säule ein wesentlicher Bestandteil der Methode ist. Diese wird durch die Abmessungen und die Säulenpackung (bzw. L-Gruppen-Klassifizierung gemäß USP-Datenbank) spezifiziert. 

In Tabelle 1 sind einige für die IC-Analyse relevante L-Gruppen zusammen mit ihrer Beschreibung und entsprechenden Beispielen für Metrohm-Säulen aufgelistet. Diese sind in der USP-Säulendatenbank zu finden [22] und sind auch im Kapitel „Reagenzien“ der USP-Dokumente aufgeführt [23].

Tabelle 1. SP-Säulenpackung, L-Gruppen, Definitionen, kompatible Trennsäulen von Metrohm und die USP-Monographien, sofern diese anwendbar sind.

Packung	Beschreibung	Konforme Metrohm-Säule	USP-Monographie(n)
L46	Polystyrol/Divinylbenzol-Substrat, agglomeriert mit quaternären Amin-funktionalisierten Latexkügelchen (Durchmesser 9–11 µm).	Metrosep A Supp 1 - 250/4,6	Voriconazol, topische Natriumfluorid- und angesäuerte Phosphatlösung, orale Natriumfluoridlösung, <345>-Test für Zitronensäure/Citrat und Phosphat
L76	Schwaches Kationenaustauschmaterial auf Silikatbasis, 5 µm Durchmesser. Das Substrat besteht aus oberflächenpolymerisierter Polybutadien-Maleinsäure, um Carbonsäurefunktionen bereitzustellen. Kapazität nicht weniger als 29 µEq/Säule.	Metrosep C 4 - 250/4,0 Metrosep C 6 - 150/4,0	Calciumacetat-Kapseln, Kaliumcitrat und Zitronensäure als Lösung zum Einnehmen, Kaliumbicarbonat-Brausetabletten zur Herstellung einer Lösung zum Einnehmen, Kalium- und Natriumbicarbonate und Zitronensäure-Brausetabletten zur Herstellung einer Lösung zum Einnehmen, Kaliumbicarbonat und Kaliumchlorid-Brausetabletten zur Herstellung einer Lösung zum Einnehmen (Kalium)
L91	Starkes Anionenaustauscherharz, bestehend aus monodispersen porösen Polystyrol/Divinylbenzol-Kügelchen (Durchmesser 3–10 µm), gekoppelt mit quaternären Ammoniumgruppen.	Metrosep A Supp 10 - 250/4,0 Metrosep A Supp 16 - 100/4,0 Metrosep A Supp 17 - 150/4,0 Metrosep A Supp 19 - 150/4,0	Zinkoxid, Zinkoxid neutral, Zinkoxidpulver, Zinksulfat-Augenlösung, <591> Zinkbestimmung, Natriumfluorid, Natriumfluorid-Gel, Natriumfluorid-Lösung zum Einnehmen, Kaliumbicarbonat- und Kaliumchlorid-Brausetabletten zur oralen Lösung, Natriumfluorid-Tabletten, Zinnfluorid, Natriummonofluorphosphat, Zinnfluoridgel, zusammengesetzte Kaliumphosphat-Injektion, Natriumchlorid-Tabletten zur Lösung, zusammengesetzte Natriumphosphat-Injektion
L97	Schwaches Kationenaustauscherharz, bestehend aus einem hochvernetzten Kern aus 5,5 µm großen porösen Partikeln mit einer Porengröße von 2000 Å und bestehend aus Ethylvinylbenzol, vernetzt mit 55 % Divinylbenzol. Das Substrat ist oberflächengepfropft mit Carbonsäure-funktionalisierten Gruppen. Kapazität nicht weniger als 2400 µEq/Säule (4 mm x 25 cm).	Metrosep C Supp 2 - 250/4,0	Natriumbicarbonat-Compound Injektion, Natriumphosphat-Compound-Injektion
L105	Ein starkes Anionenaustauscherharz, bestehend aus hochvernetzten supermakroporösen (2000 Å) Partikeln mit einer Größe von 9 µm, funktionalisiert mit sehr schwach vernetztem Latex (0,2 %), um quartäre Alkyl-Ammoniumionenstellen bereitzustellen.	Metrosep A Supp 4 - 250/4.0	Natriumnitrit

Akzeptanzkriterien der USP-Methode für Säulen

Zunächst muss die Säule einer bestimmten L-Kategorie zugeordnet werden. Die Materialien für jede L-Gruppe oder Kategorie haben bestimmte Eigenschaften und eine bestimmte Säulenphysiochemie (Beispiele siehe Tabelle 1). Diese müssen zu den Eigenschaften und der Säulenchemie der jeweiligen Trennsäule passen. Eine L-Gruppe kann verschiedene Säulen eines einzelnen Anbieters oder verschiedener Hersteller umfassen. 

Wenn die USP eine einzelne Säule einer L-Gruppe zuordnet, können die Bedingungen, die in einer Monographie beschrieben werden, qualifiziert werden (z. B. Zinkoxidbestimmung gemäß USP <591> [24]; AN-U-076). Für jede IC-Methode wird die L-Gruppe angegeben –keine bestimmte Säule. Dies ermöglicht dem Anwender je nach Vorliebe eine gewisse Flexibilität bei der Auswahl einer Säule derselben L-Gruppe für die Methodenqualifizierung (Tabelle 1).

Säulenäquivalenz

Die Säulenäquivalenz ermöglicht es Laboratorien und Herstellern nun, Säulen für validierte chromatografische Methoden zu qualifizieren. Abbildung 1 zeigt die allgemeine Vorgehensweise.

Es gibt zwei Möglichkeiten zur Durchführung der Säulenäquivalenztests, ohne dass eine vollständige Validierung erforderlich ist:

Der Benutzer wählt eine Säule aus, die zu derselben L-Gruppe gehört, die für die vollständig validierte Methode angegeben wurde
Der Benutzer wählt eine Säule aus, die zu einer L-Gruppe gehört, die in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften der stationären Phase ähnlich ist, ohne dass sich die Identität des Substituenten ändert

USP General Chapter <621> [18] spezifiziert die Anforderungen für dieses Verfahren sowie die Eignungs- und Akzeptanzkriterien der validierten Methode, für die die Säule qualifiziert werden muss.

Abbildung 1. Illustriertes Schema, das zeigt, wie gleichwertige Trennsäulen von der USP vorgeschlagen, überprüft, genehmigt und akzeptiert werden.

Erfolgreiche Säulenäquivalenzstudien von Metrohm

Metrohm ist an der Durchführung vollständiger USP-Methodenvalidierungen beteiligt. Ein Beispiel ist in der Application Note AN-S-398 beschrieben:„Phosphat in Natrium- und Kaliumphosphat-Compound-Injektionen“. Hierfür wurde die Säule Metrosep A Supp 17 - 150/4,0 zur Bestimmung von Phosphat verwendet.

Mehrere Metrohm-Säulen (Tabelle 1) wurden im Rahmen des Säulenäquivalenzverfahrens für USP-Methoden qualifiziert. Weitere Beispiele sind die Validierung der Metrosep A Supp 4 - 250/4.0 Säule zur Bestimmung von Nitrit in Natriumnitrit (AN-S-400) oder der Metrosep A Supp 1 Säule zur Quantifizierung von Voriconazol, wie im Folgenden näher erläutert wird.

Anwendungsbeispiel: Analyse von Voriconazol

Die Metrosep A Supp 1 Die Säule wurde von der USP für die Analyse der mit Voriconazol verwandten Verbindung F qualifiziert. Voriconazol ist ein Medikament zur Behandlung schwerer Pilzinfektionen [25]. In Tabelle 2 sind alle USP-Anforderungen und Methodenparameter sowie die erreichten Leistungsmerkmale für die Säulenäquivalenzstudie aufgelistet.

Die Studie wurde mit einem 940 Professional IC Vario System durchgeführt unter Verwendung von Voriconazol-verwandte Verbindung F RS-Lösungen. Für die Systemeignungstests wurden unterschiedliche Konzentrationen (2,5–5 µg/ml) und Zusammensetzungen verwendet (Tabelle 3). Zusätzlich wurde eine Probe einer Voriconazol-Lösung getestet (Chargen-Nr.: VZFP22009, Tabelle 4).

Tabelle 2. Anforderungen hinsichtlich der Säulenäquivalenz für Voriconazol-verwandte Verbindung F gemäß USP.

Voriconazol-verwandte Verbindung F gemäß USP – Übersichtstabelle
Parameter	USP-Monographie	Metrohm
Eluent (mobile Phase)	Natriumhydroxidlösung: 470 g/L Natriumhydroxid in Wasser Mobile Phase: Methanol, Wasser und Natriumhydroxidlösung (500:1500:0,175)	Identisch mit USP-Monographie
Chlorid-Stammlösung	86 μg/mLNatriumchlorid in Wasser	Identisch mit USP-Monographie
Standard-Stammlösung	250 μg/mL USP-Voriconazol-verwandte Verbindung F RS. In 50 % des Endvolumens mit Methanol auflösen und mit der mobilen Phase auf das Endvolumen verdünnen.	Identisch mit USP-Monographie
Standardlösung	5,0 μg/mL USP Voriconazol-verwandte Verbindung F RS aus der Standard-Stammlösung in einer Mischung aus Methanol und mobiler Phase (50:50)	Identisch mit USP-Monographie
Systemeignungslösung A	5 μg/mL USP VVoriconazol-verwandte Verbindung F RS aus der Standard-Stammlösung und 1,7 μg/ml Natriumchlorid in einer Mischung aus Methanol und mobiler Phase (50:50)	Identisch mit USP-Monographie
Systemeignungslösung B	2,5 μg/mL Voriconazol-verwandte Verbindung F RS aus der Standardlösung in der mobilen Phase	Identisch mit USP-Monographie
Beispiellösung	5 mg/mL Voriconazol. In 50 % des Endvolumens mit Methanol auflösen und mit der mobilen Phase auf das Endvolumen verdünnen.	Identisch mit USP-Monographie
Erkennung	Leitfähigkeit mit Suppression	Wie USP-Monographie: Leitfähigkeit mit Suppression (MSM_ChS)
Säule	4 mm × 5 cm Vorsäule und 4 mm × 25 cm Analysesäule; beide Packung L46	Metrosep A Supp 1 Guard/4.6 (Teilenummer: 6.1005.340) Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 (Art.-Nr.: 6.1005.300)
Flussrate	1,0 mL/min	Identisch mit USP-Monographie
Injektionsvolumen	20 µL	Identisch mit USP-Monographie
Laufzeit	nicht erwähnt	60 Minuten
Säulentemperatur	40 °C	Identisch mit USP-Monographie

Das Metrohm IC-System mit der Metrosep A Supp 1 - 250/4.6 Säule erfüllte die USP-Eignungskriterien für die Analyse der mit Voriconazol-verwandten Verbindung F RS (Tabelle 3).

Tabelle 3. Bestimmung der Eignung des Metrohm IC-Systems im Vergleich zu den Anforderungen der USP-Monographie für die Analyse von Voriconazole Related Compound F (VRC-F).

Systemeignung (n=6)	USP Monographie	Metrohm
Tailing-Faktor (Systemeignungslösung B)	NMT 2.0 für VRC-F-Peak	1.219 (BESTANDEN)
Relative Standardabweichung (Systemeignungslösung B)	NMT 10,0 % für VRC-F-Ion	2,347 % (BESTANDEN)
Auflösung zwischen VRC-F-Ion und Chlorid-Ion (Systemeignungslösung A)	NLT 3.5	11.41 (BESTANDEN)

Diese Studie erfüllte auch das Akzeptanzkriterium für die Voriconazol-Probenanalysen (Tabelle 4) und wurde von der USP akzeptiert. Ein Beispielchromatogramm der mit Voriconazol-verwandten Verbindung F ist in Abbildung 2 dargestellt.

Tabelle 4. USP-Akzeptanzkriterium für die Analyse von Voriconazol mittels Ionenchromatographie.

Voriconazol (Chargennummer: VZFP22009)	USP-Monographie	Metrohm
Durchschnittliche Probenergebnisse: Dreifache Probenvorbereitung (Voriconazol-Probenlösung)	NMT 0,1 %	0,04 % (BESTANDEN)

Abbildung 2. Beispielchromatogramm eines USP-Referenzstandards für Voriconazol-verwandte Verbindung F, bestimmt mit der Metrosep A Supp 1-Säule.

Die Bedeutung der Säulenäquivalenz für die pharmazeutische Analyse

Spezielle Labor-Ionenchromatographiesysteme können von USP-validierten Aufbauten abweichen. Dies ist vor allem auf die verwendeten Chromatographiesäulen zurückzuführen. Die Initiative zur Modernisierung der USP-Monographien hat die Auswahl der Säulen für die Forscher erweitert. Dies ist für die pharmazeutische Industrie von großem Vorteil.

Säulenäquivalenzstudien ermöglichen die Verwendung alternativer Analysesäulen für hochwertige pharmazeutische Analysen. Dadurch wird eine erhebliche Zeit- und Arbeitsersparnis erzielt, da ein mehrwöchiges Verfahren zur vollständigen Methodenvalidierung entfällt. Letztendlich wird die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Analyseergebnisse weiterhin gemäß der validierten Methode erreicht.

Metrohm bietet mehrere USP-validierte Anwendungen sowie alternative Säulen für validierte USP-Methoden an, die durch erfolgreiche Säulenäquivalenzstudien genehmigt wurden.

[1] Das Arzneibuchübereinkommen der Vereinigten Staaten. Monographie Modernisierungsgeschichte. https://www.usp.org/get-involved/partner/monograph-modernization-history (abgerufen am 13.09.2023).

[2] Kappes, S. Wenn die HPLC versagt: IC in der Lebensmittel-, Wasser- und Pharmaanalyse. Weißes Papier, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2019.

[3] Kappes, S.; Steinbach, A.; Ruth, K. IC: Der Alleskönner in der Pharmaanalytik. Weißes Papier, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2017.

[4] Metrohm AG. Pharmazeutische Analyse: Qualitätskontrolle von Arzneimitteln. Broschüre, 8.000.5139DE, Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2015.

[5] Subramanian, N. H.; Wille, A. Inline-Probenvorbereitung – ein effektives Werkzeug für die Ionenanalyse in pharmazeutischen Produkten. Metrohm AG, 8.000.6010.

[6] Metrohm AG. Bringen Sie Ihre USP-Methoden auf den neuesten Stand! – Die Vorteile der Metrohm-Ionenchromatographie für Ihre Analytik von APIs, Verunreinigungen und Hilfsstoffen. Broschüre, 8.000.5436DE, Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2023.

[7] Jenke, D. Anwendung der Ionenchromatographie in der Pharma- und Arzneimittelanalyse. Zeitschrift für chromatographische Wissenschaft 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[8] Metrohm AG. Qualitätskontrolle von Dialysekonzentraten; Anwendungshinweis, AN-D-003; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2022.

[9] Metrohm AG. Qualitative Bestimmung von Anionen im Urin zur Verifizierung von Verfälschungen; Anwendungshinweis, AN-S-215; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2005.

[10] Metrohm AG. Mannitol, Rhamnose, Lactulose und Lactose im Blutserum mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD); Anwendungshinweis, AN-P-063; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2016.

[11] Metrohm AG. Standardmethoden in der Wasseranalyse; Bewerbungsbulletin, AB-221; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2015.

[12] Bruttel, A.; Seifert, N.; Läubli, M.; et al. Monographie: Analyse von Wasserproben und Wasserbestandteilen mit Metrohm-Geräten, 8.108.5071EN; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2021.

[13] Ruth, K. Messung organischer Säuren und anorganischer Anionen mit Ionenchromatographie-Massenspektrometrie. weißes Papier WP-086EN; Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2023.

[14] Metrohm AG. Spurenüberwachung in destilliertem Wasser mittels Ionenchromatographie; Anwendungshinweis, AN-Q-008; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2015.

[15] Gandhi, J.; Pfundstein, P.; Martin, C.; et al. Überwachung jod- und gadoliniumhaltiger Kontrastmittel in Wasseraufbereitungsanlagen; Technisches Poster, 8.000.6085DE; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2012.

[16] Pfundstein, P.; Martin, C.; Schulz, W.; et al. IC-ICP-MS-Analyse von Gadolinium-basierten MRT-Kontrastmitteln (TA-023); LCGC Asien-Pazifik, 2011.

[17] Metrohm AG. Abwasseranalyse in Kläranlagen. Broschüre, 8.000.5142DE, Metrohm AG, Herisau, Schweiz 2015.

[18] U. S. Pharmakopöe/Nationales Formularbuch. Allgemeines Kapitel, <621> Chromatographie; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[19] U. S. Pharmakopöe/Nationales Formularbuch. Allgemeines Kapitel, <1065> Ionenchromatographie; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M897_01_01

[20] U. S. Pharmakopöe/Nationales Formularbuch. Allgemeines Kapitel, <1225> Validierung kompendialer Verfahren; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[21] Schäfer, H.; Läubli, M. Monographie Ionenchromatographie, 8.108.5077EN; Metrohm AG: Herisau, Schweiz, 2023.

[22] U. S. Pharmakopöe. Chromatografische Säulen; USP: Rockville, MD, USA, 2023.

[23] U. S. Pharmakopöe/Nationales Formularbuch. Reagenzien; USP-NF: Rockville, MD, USA, 2023.

[24] U. S. Pharmakopöe/Nationales Formularbuch. <591> Zinkbestimmung. In Generalkapitel; USP/NF, Rockville, MD, USA; DOI:10.31003/USPNF_M99350_05_01

[25] ASHP. AHFS® Patient Medication Information™: Voriconazol, 2023.