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Esta es la tercera y última publicación de nuestra serie que le brinda consejos y trucos sobre el uso adecuado de las columnas de cromatografía iónica. En la primera parte, discutimos principalmente las condiciones estándar de operación así como los límites operacionales para las columnas, mientras que en la segunda publicación, nos enfocamos en temas relacionados con la aplicación y qué parámetros de elución se pueden cambiar para modificar el rendimiento de la separación. En la conclusión de esta serie, analizaremos más de cerca las formas de evaluar el rendimiento de la columna durante su vida útil y ofreceremos algunos consejos para la solución de problemas que pueden ayudar a solucionar los problemas que puedan surgir.
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Parámetros de columna esenciales
Comencemos observando los principales parámetros que se pueden usar para juzgar el rendimiento de la columna. La mayoría de estos valores de referencia se pueden extraer del certificado de análisis. Los certificados de la columna de separación se pueden encontrar en el Buscador de certificados Metrohm. Reproducir periódicamente el cromatograma del certificado para verificar el rendimiento de la columna puede resultar útil para detectar cambios en el rendimiento de forma temprana y evitar daños irreversibles a la columna.
Buscador de certificados Metrohm
A continuación, consideraremos los parámetros más importantes uno por uno.
Tiempo de retención y capacidad de la columna
El tiempo de retención de los analitos individuales es una buena medida de la capacidad y selectividad de la columna. Cuando los tiempos de retención de los analitos no coinciden con los tiempos de retención del certificado, existen muchas razones posibles para este comportamiento.
Posiblemente, la composición del eluyente es incorrecta, por ejemplo, porque los componentes del eluyente no están presentes en las concentraciones correctas. En caso de que la fuerza del eluyente sea demasiado alta, los tiempos de retención se reducirán. Este fenómeno suele ocurrir para todos los iones simultáneamente y acerca todos los picos. De este modo, los iones multivalentes se aceleran en mayor medida que los iones monovalentes. Este problema se puede solucionar preparando un eluyente nuevo con la composición correcta.
El eluyente puede no ser fresco o no estar suficientemente protegido de la atmósfera circundante, por ejemplo, con un CO2 adsorbente. El dióxido de carbono del aire ambiente puede cambiar la composición del eluyente (es decir, la fuerza, el pH, etc.) con el tiempo y esto afectará los tiempos de retención de los analitos. Los eluyentes de hidróxido débiles se ven particularmente afectados por este problema, ya que la fuerza de elución de los iones de carbonato es mucho más fuerte que la de los iones de hidróxido, lo que genera fuertes cambios en los tiempos de retención. Por lo tanto, los iones multivalentes se ven más afectados por esto que los monovalentes. Este problema se puede solucionar preparando un eluyente fresco y usando un CO2 adsorbente Cuando se trabaja con eluyentes de hidróxido, también es importante verificar el estado de la solución madre de hidróxido, ya que puede absorber CO2 desde el aire. La Figura 1 muestra el efecto del CO2 captación del aire sobre los tiempos de retención de los aniones comunes.
Algunas muestras pueden contener componentes que ocupan los grupos de intercambio iónico del material de la columna. En ese caso, el número de grupos de intercambio de iones disponibles en la columna se reduce en comparación con el estado inicial, lo que conduce a una capacidad de columna aparentemente más pequeña y tiempos de retención más cortos. Según el tipo de contaminante, existen posibilidades de revertir este efecto y eliminarlos de la superficie de la columna. Estos procedimientos de regeneración se adaptan individualmente a las diferentes fases estacionarias y debe usarse como ultima opción para guardar una columna.
Los procedimientos así como los límites de operación se describen en los respectivos folletos de la columna y se pueden encontrar en nuestro sitio web. Consulte a su distribuidor Metrohm antes de realizar un procedimiento de regeneración.
- En caso de que la contaminación provenga de un ion multivalente, normalmente es posible eliminarlos lavando la columna con un eluyente de mayor concentración. Al hacerlo, no olvide los límites de operación de la columna, particularmente en lo que respecta al pH del eluyente.
- A veces, las moléculas orgánicas pueden adsorberse en la fase estacionaria de la columna debido a su fuerte afinidad con ella. Esto puede provocar un bloqueo de los grupos de intercambio de iones y tiempos de retención reducidos junto con una mayor presión de funcionamiento. Cuando esto sucede, puede ayudar lavar la fase estacionaria con un eluyente que contenga una fracción de un modificador orgánico. Esto aumentará la afinidad del contaminante con la fase móvil y ayudará a separarlo de la fase estacionaria.
Por lo general, después de un procedimiento de regeneración de este tipo, se puede restaurar la capacidad original de la columna.
Una forma aún mejor de prolongar la vida útil de la columna de separación es intercambio regular de la columna de guardia. Uno de sus propósitos es proteger la columna de separación de los contaminantes reteniéndolos.
Asegúrese de cambiar la precolumna tres o cuatro veces durante la vida útil de la columna de separación, o incluso con más frecuencia cuando se trate de matrices de muestras muy complejas, como colorantes o matrices alimentarias. En estas situaciones, sugerimos usar el Metrosep RP 2 Guardia/3.5.
La superposición del cromatograma en Figura 2 muestra el efecto de una precolumna defectuosa en la forma del pico.
En algunos casos, la capacidad de la columna se reduce debido a la modificación química de la fase estacionaria. Esto sucede cuando una columna se usa en condiciones fuera de los límites de operación, por ejemplo, situaciones de pH extremo. Las condiciones extremas de pH pueden alterar los enlaces químicos de los grupos de intercambio iónico con el sustrato de partículas base. Este proceso irreversible lleva a pérdida permanente de capacidad de la columna. En este caso, ningún procedimiento de regeneración puede restaurar la capacidad original de la columna.
Tenga en cuenta que esta pérdida de grupos de intercambio iónico también ocurre lentamente durante el uso regular de las columnas de intercambio iónico. La fuerza del enlace químico de los grupos de intercambio iónico se prueba minuciosamente durante el desarrollo de las columnas Metrohm para proporcionar una larga vida útil de la columna.
Placas teóricas y simetría de pico
El número de platos teóricos (TP) puede ser una herramienta útil para juzgar el estado de relleno de la columna. Cuanto mayor sea el valor de TP, mejor será el relleno de la columna. Para una evaluación significativa del lecho de relleno de la columna, elija un analito que no eluya demasiado pronto en el cromatograma (estos picos pueden verse afectados por efectos extracolumna, en particular en sistemas de 2 mm) y que no se vea afectado por interacciones secundarias ( es decir, evite usar nitrato). Para cationes, potasio es una buena opción, mientras que para los aniones, sulfato es una elección adecuada.
Aunque las columnas se empaquetan a presiones superiores a la presión de funcionamiento normal, el lecho de empaque continúa densificándose aún más a lo largo de la vida útil de la columna con la aplicación continua del flujo de fase móvil (eluyente). Si bien el lecho de relleno de la fase estacionaria mejora debido a este efecto, también puede dar lugar a cierto volumen muerto en la entrada de la columna de separación. Este volumen muerto puede ser responsable del ensanchamiento de picos y platos teóricos reducidos, particularmente al comienzo del cromatograma.
Si bien este es un proceso regular de envejecimiento de la columna, es posible ralentizarlo cuidando bien la columna. Las acciones preventivas incluyen la iniciación lenta del caudal y la temperatura del eluyente en el arranque, así como el apagado correcto y completo de la bomba de alta presión antes de retirar la columna, ya que la tensión mecánica puede ser perjudicial para el lecho de relleno. El cambio de la precolumna a menudo puede tener un impacto positivo en las placas teóricas y las formas de los picos (ver Figura 2).
Los problemas con el lecho de relleno de la columna a menudo también se vuelven visibles en los valores del factor de asimetría y las formas generales de los picos. Más pronunciado al frente así como también ensanchamiento del pico pueden ser señales de advertencia para la canalización en la columna o la columna de guardia. Desafortunadamente, este tipo de daño en la columna es irreversible y requiere un reemplazo de la columna de separación.
Antes de reemplazar la columna, es importante verificar si los problemas se originaron en la columna o en otra conexión en el sistema IC siempre que se observe un ensanchamiento de picos en el cromatograma. Asegúrese de que todos los capilares en la ruta de alta presión tengan un diámetro de ≤0,25 mm y que todos los capilares se hayan instalado y conectado correctamente sin volumen muerto adicional. Los sistemas equipados con columnas de diámetro interno pequeño (2 mm, microbore) se ven más afectados por el volumen muerto que aquellos con columnas de 4 mm. Esto significa que cuando se utilizan columnas microbore, se requiere menos volumen muerto para que el efecto de ensanchamiento del pico sea visible en comparación con las columnas de 4 mm.
Presión de columna
Otro parámetro importante que se debe comprobar regularmente durante la vida útil de la columna es la presión del sistema. La alta presión es una de las razones más frecuentes que conducen al reemplazo de una columna. Siempre que se observe un aumento de presión, es importante verificar qué parte del sistema IC es la causa.
Si la muestra contiene partículas y se aplica una preparación de muestra insuficiente, las partículas se acumularán en la entrada de la columna protectora y, finalmente, provocarán un aumento de la presión del sistema. En este caso, la precolumna realiza el uso previsto de proteger la columna de separación y necesita ser reemplazada. Si la precolumna no se reemplaza lo suficientemente pronto, la contaminación por partículas puede filtrarse y cargarse en la columna de separación. Si bien no existe un procedimiento de regeneración para una precolumna cargada con partículas, las columnas de separación contaminadas con partículas se pueden regenerar enjuagando la columna a velocidades de flujo bajas en la dirección inversa del flujo.
Tenga en cuenta que es posible que estos procedimientos de regeneración no siempre tengan éxito.
Evitar que se inyecten partículas en la ruta de alta presión del sistema IC es una buena manera de proteger las columnas de protección y separación. Metrohm ofrece varias técnicas automatizadas de preparación de muestras que resultan en un impacto positivo en la vida útil de la columna. Las técnicas más comunes para este fin son la ultrafiltración en línea (figura 3) y diálisis en línea.
Obtenga más información sobre la ultrafiltración en línea de Metrohm en nuestra publicación de blog relacionada.
¿Cuándo tengo que cambiar la membrana de filtración por Ultrafiltración Inline?
Fin de la vida de la columna
Todos los parámetros descritos anteriormente deben tenerse en cuenta para evaluar el rendimiento de la columna (y del sistema IC). Muchos de estos parámetros pueden ser monitoreados de cerca en el Software MagIC Net para que un posible problema pueda detectarse lo antes posible.
Aunque las columnas IC de Metrohm están diseñadas y fabricadas para tener una vida útil muy larga, en algún momento el rendimiento disminuirá e incluso los procedimientos de regeneración pueden no ser capaces de restaurar el rendimiento de la columna requerido para resolver las necesidades de la aplicación. Esto representa el final de la vida útil de la columna y hace que el cambio de la columna de separación sea inevitable.
Las columnas de separación Metrohm no se pueden reciclar y pueden desecharse con los residuos normales. Sin embargo, dependiendo de las muestras medidas, así como de los tipos de productos químicos utilizados y sus peligros asociados, puede ser necesario considerar una opción de eliminación adecuada.
Independientemente de la naturaleza de la muestra, no abras la columna en cualquier momento.
Descripción general de la resolución de problemas
La tabla 1 brinda una descripción general sobre ciertas estrategias de solución de problemas al observar el comportamiento del rendimiento de su columna.
Tabla 1. Prevención y corrección de la pérdida de rendimiento en columnas IC
| Indicador | Causa | Medidas preventivas y correctivas |
|---|---|---|
| Contrapresión creciente | Partículas en la columna de guardia | Sustituya la precolumna. |
| Partículas en la columna de separación | Enjuague la columna de separación en la dirección de flujo inversa
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| Partículas en la muestra | Preparación de muestras, p. ej., eliminación de partículas mediante ultrafiltración en línea | |
| Tiempo de retención reducido | Carbonato en el eluyente | El dióxido de carbono del aire afecta el equilibrio de carbonato/carbonato de hidrógeno en el eluyente. Un eluyente de carbonato/carbonato de hidrógeno se debilita con el tiempo; un eluyente de hidróxido fortalece.
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| Burbujas de aire en el eluyente | Las burbujas de aire hacen que el flujo de eluyente sea inestable. La contrapresión es un indicador de flujo inestable. Debería permanecer estable dentro de un rango de ± 0,1 MPa.
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| Pérdida de capacidad en la columna debido a iones de alta valencia | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito inorgánico. | |
| Pérdida de resolución | Eluyente demasiado viejo o producido incorrectamente | Los eluyentes deben estar recién preparados. Asegúrese de que se produzcan correctamente y, en particular, de que no se confundan el carbonato y el carbonato de hidrógeno. |
| Efecto adsortivo de la contaminación depositada en la precolumna | Sustituya la precolumna. | |
| Efecto adsortivo de la contaminación depositada en la columna de separación | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. | |
| Pérdida de placas teóricas | Columna de seguridad contaminada | Sustituya la precolumna. |
| Columna de separación contaminada | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. | |
| Columna de separación sobrecargada | La columna de separación puede sobrecargarse por factores como un alto contenido de sal en la matriz de la muestra.
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| Volumen muerto en el sistema IC |
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| Asimetría | Volumen muerto o contaminación en la precolumna | Sustituya la precolumna. |
| Columna de separación contaminada | Regenere la columna según el prospecto de la columna para eliminar cualquier depósito orgánico o inorgánico. |
Conclusión
Este artículo explica cómo se puede evaluar y monitorear el rendimiento de la columna IC a lo largo de la vida útil de la columna y qué medidas se pueden tomar para garantizar una vida útil prolongada de la columna. Con eso, ahora concluimos la serie «Buenas prácticas para columnas de separación en cromatografía iónica». Si tiene más preguntas, no dude en ponerse en contacto con su vendedor local de circuitos integrados de Metrohm.
