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La seconda parte di questa serie di blog sulle migliori pratiche per le colonne di separazione IC si concentra sugli argomenti relativi alle applicazioni che hanno un impatto sull'idoneità e sulla stabilità delle colonne. In primo luogo, c'è la scelta corretta della colonna che meglio si adatta all'applicazione prevista. Passiamo quindi ai parametri operativi che possono essere modificati per ottimizzare la separazione tra analiti e quali sono i rispettivi effetti e possibilità.
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Scelta della lunghezza e del diametro della colonna
Metrohm offre un'ampia gamma di colonne IC che contengono diverse fasi stazionarie, hanno lunghezze e/o diametri interni differenti. La scelta della fase stazionaria ha un grande impatto sulla selettività tra i singoli analiti da un lato e sulla stabilità rispetto a diverse matrici di campioni dall'altro. Invece, la lunghezza della colonna non ha alcun impatto sulla selettività, ma piuttosto sull'efficienza di separazione tra i singoli picchi.
Scopri di più sull'ampia selezione Metrohm di colonne di separazione per cromatografia ionica nel nostro Catalogo colonne.
Equilibrio
Oltre alle condizioni operative standard, i parametri di avvio svolgono un ruolo importante per la durata della colonna di separazione. Un elevato stress meccanico e termico è una causa frequente della riduzione della durata della colonna. Si raccomanda pertanto di aumentare lentamente la portata dell'eluente alla colonna ed evitare shock termici e di pressione. Per ulteriori informazioni sulle specifiche, fare riferimento alle condizioni di equilibrio raccomandate nel foglio illustrativo della colonna corrispondente.
Effetti della lunghezza della colonna
Nei seguenti cromatogrammi (Figura 1), viene mostrato l'effetto della lunghezza della colonna sull'efficienza di separazione per la serie di colonne Metrosep A Supp 17. Ogni volta che scegli una lunghezza di colonna, dovresti prendere il complessità della separazione prevista e la presenza di componenti della matrice che potrebbe disturbare gli ioni di interesse in considerazione.
Effetti del diametro della colonna
Oltre a fornire diverse lunghezze di colonne di separazione IC, Metrohm offre anche la maggior parte delle colonne nelle versioni diametro interno 4 mm e diametro interno 2 mm (note come «microbore»). Al riguardo, ci sono diversi criteri per distinguerle:
- Se utilizzi sistemi online in a modalità continua (ovvero sistemi che funzionano incustoditi per diversi giorni di seguito come il sistema Metrohm Process Analytics MARGA – Monitorare per AeRosols e Gas dentro Aria ambiente), si consiglia di utilizzare colonne IC da 2 mm. A causa della portata ridotta per le colonne microbore (solo il 25% della portata per le colonne da 4 mm), l'eluente e le soluzioni rigeneranti durano molto più a lungo, il che aumenta il tempo in cui lo strumento può essere lasciato incustodito.
- Ci sono applicazioni che richiedono tecniche con trattino come IC-MS per una maggiore selettività e sensibilità dell'analita. In questo caso, l'uso di colonne da 2 mm è l'ideale. La bassa portata è ottimale per il processo di elettrospray e quindi non è necessario un divisore di flusso prima di entrare nello spettrometro di massa.
- A volte, è disponibile solo una quantità limitata di campione per l'iniezione. In queste situazioni sono da preferire colonne da 2 mm. Questo perché durante il processo di separazione si verifica una minore diluizione/diffusione e quindi si ottengono segnali più elevati.
- D'altra parte, se il campione contiene un carico elevato di componenti della matrice, la scelta di colonne IC da 4 mm adatte sarà una scelta migliore a causa della maggiore capacità disponibile per separare gli analiti desiderati dalla matrice.
Scopri di più su MARGA e le sue capacità per il monitoraggio continuo della qualità dell'aria nel nostro post sul blog.
Ottimizzazione della separazione degli analiti
Accanto alla colonna stessa, possono essere modificati diversi altri parametri per ottimizzare la selettività della separazione. Questi parametri includono temperatura, componenti dell'eluente, forza e modificatori organici.
Effetti della modifica della temperatura
Uno dei modi più semplici per mettere a punto la selettività di separazione in IC è modificare la temperatura dell'analisi. Ciò si ottiene utilizzando il forno a colonna integrato nello strumento (se disponibile). È possibile osservare molteplici effetti, ad esempio nell'analisi anionica. Ad esempio, l'impatto della temperatura sulla selettività è mostrato nella sovrapposizione del cromatogramma (figura 2) per la linea di colonna Metrosep A Supp 17 linea di colonne.
- Gli ioni monovalenti come fluoruro, cloruro, nitrito, bromuro e nitrato sono tutti accelerati con l'aumento della temperatura, indicando che si verificano meno interazioni con la fase stazionaria.
- Il comportamento di ioni multivalenti come fosfato o solfato è più complicato da descrivere e varierà con ciascuna fase stazionaria. In generale, gli ioni multivalenti sono più ritardati a temperature più elevate, il che fa aumentare i tempi di ritenzione, come si può vedere per il solfato. Il fosfato invece si comporta in modo diverso, a causa della variazione indotta dalla temperatura del pH dell'eluente in un intervallo vicino al pKa valore di fosfato. A causa di questo cambiamento di pH, cambia anche la carica effettiva dello ione fosfato (in questo esempio, la carica effettiva si riduce all'aumentare della temperatura).
- La forma del picco degli ioni polarizzabili come nitrito, bromuro e in particolare nitrato è notevolmente migliorato a temperature più elevate. La ragione di questo comportamento è la riduzione delle interazioni secondarie con la fase stazionaria.
Effetti della modifica della composizione e della forza dell'eluente
La composizione e la forza dell'eluente possono essere utilizzate per modificare l'ordine di eluizione di diversi analiti utilizzando la stessa colonna di separazione. Nella cromatografia cationica, un modello di ritenzione è stato sviluppato da PR Haddad e PE. Jackson, che consente ai ricercatori di prevedere i tempi di ritenzione quando si cambia la composizione dell'eluente [1].
Considerando che la colonna rimane identica in ogni determinazione, non è prevedibile alcun cambiamento dell'equilibrio di scambio ionico e della capacità della colonna. Pertanto, quando si cambia solo la concentrazione dell'eluente, si può utilizzare la seguente correlazione:
Dove:
- K' è il fattore di ritenzione dell'analita di interesse
- C è una costante
- X è la carica dell'analita
- y è la carica dell'eluente
- ey+m è la concentrazione dell'eluente nella fase mobile
Se si utilizza acido nitrico come eluente, y = 1, e il modello può essere semplificato in:
Applicare questa formula a situazioni pratiche in laboratorio significa quanto segue: aumentando la forza dell'eluente, i metalli alcalino terrosi vengono accelerati molto più velocemente (X = 2) rispetto ai metalli alcalini (X = 1), e quindi è possibile eluire il magnesio prima del potassio. Questo effetto è chiamato elettroselettività.
Gli ioni metallici multivalenti sono in grado di formare complessi con agenti complessanti dedicati. Pertanto, le selettività possono essere modificate aggiungendo agenti complessanti all'eluente. Ad esempio, l'acido dipicolinico (DPA) è spesso usato per complessare il calcio, il che porta a una riduzione della carica effettiva del calcio. Di conseguenza, il tempo di ritenzione del calcio si riduce e il calcio eluisce prima del magnesio nel cromatogramma (Figura 3).
La ritenzione di cationi monovalenti può essere influenzata dall'aggiunta di etere corona alla fase mobile.
I sistemi anionici sono più complessi per quanto riguarda il modello del tempo di ritenzione, sebbene lo stesso effetto di elettroselettività possa essere osservato in una certa misura per gli anioni. Tuttavia, quando si cambia la forza dell'eluente, anche il pH dell'eluente cambia frequentemente, portando a diversi equilibri di deprotonazione degli anioni multivalenti (es. fosfato). Ciò influenza la carica effettiva dell'analita e, così facendo, influenza anche la sua ritenzione in modo simile a quanto descritto in precedenza per gli effetti del cambiamento di temperatura.
In alcuni casi, l'uso di una piccola quantità di un modificatore organico come metanolo, acetonitrile o acetone nell'eluente può avere senso:
- Se la contaminazione batterica è stata un problema in precedenza, l'aggiunta del 5% di metanolo all'eluente può aiutare a prevenire la futura crescita batterica.
- Quando è necessario iniettare campioni contenenti molti solventi organici e non è possibile alcun pretrattamento del campione come l'estrazione o l'eliminazione della matrice (MiPCT-ME), si consiglia di aggiungere un modificatore organico adatto all'eluente per garantire che il/i solvente(i) organici possano essere rimossi correttamente dalla colonna cromatografica
Preparazione del campione in linea Metrohm (MISP)
- Quando si utilizza IC-MS, si consiglia inoltre di aggiungere un modificatore organico all'eluente per migliorare il processo di elettrospray
Tieni presente che l'aggiunta di modificatori organici influenzerà anche le selettività di separazione. Per gli anioni standard, l'effetto è simile a quello osservato con l'aumento delle temperature: le forme dei picchi degli ioni polarizzabili come nitrito, bromuro e nitrato sono migliorate.
Gli acidi organici possono invece reagire in modo molto diverso rispetto agli anioni standard e la loro reazione dipende fortemente anche dal tipo di modificatore organico utilizzato. I cromatogrammi campione che mostrano l'effetto del modificatore organico sulla ritenzione degli analiti sono mostrati nel manuale della colonna Metrosep A Supp 10.
Scaricail manuale della colonna Metrosep A Supp 10 di seguito per vedere cromatogrammi di esempio che mostrano gli effetti del modificatore organico sul tempo di ritenzione dell'analita.
Riferimenti
[1] Haddad, P. R.; Jackson, P. E. Cromatografia Ionica: Principi e Applicazioni; Biblioteca del giornale di cromatografia; Elsevier; Distributori per Stati Uniti e Canada, Elsevier Science Pub. Co: Amsterdam, Netherlands; New York: New York, NY, USA, 1990.
