Udostępnij artykuł
Monitorowanie i utrzymywanie wydajności kolumn
Jednym z podstawowych wymagań zapewniających wiarygodne analizy chromatograficzne jest wysokowydajna kolumna separacyjna. Użytkownicy chromatografii jonowej (IC) powinni regularnie sprawdzać poprawność działania swojej kolumny. Zaobserwowanie spadku wydajności kolumny
w odpowiednim czasie pozwala podjąć szybkie kroki w celu przywrócenia
i utrzymania prawidłowego funkcjonowania kolumny, redukując tym samym przestoje w analizach próbki. W tym poście wyjaśniamy, w jaki sposób można ocenić wydajność kolumn, jakie parametry należy monitorować i jakie środki można podjąć, aby zapewnić poprawną pracę kolumn.
Znajdz odpowiednią kolumnę do Twojego oznaczenia analitycznego
Pierwsze użycie nowej kolumny separacyjnej
Przed pierwszym użyciem kolumny, zalecamy sprawdzenie jej początkowej wydajności. Źródłem odniesienia jest tutaj Certyfikat Analizy (Certificate of Analysis - CoA), który dostarczany jest z każdą zakupioną kolumną Metrohm. Pierwszą analizę należy przeprowadzić wg. warunków analizy określonych w CoA: obejmujących: szybkość przepływu, temperaturę, eluent (fazę ruchomą), stężenie analitu, objętość nastrzyku próbki i supresję.
Poprawność pracy (wydajności) kolumny można ocenić, porównując niektóre parametry wyników z wartościami wymienionymi w CoA (np. czas retencji, półki teoretyczne, asymetrię, rozdzielczość czy wysokość piku).
Regularne monitorowanie sprawności kolumn
Kolumny, które są już w użyciu, również powinny być regularnie monitorowane! Zaleca się przeprowadzanie testów ze wzorcami/próbkami kontrolnymi w warunkach używanej aplikacji Sprawność kolumny różni się w zależności od typu analizy i powiązanych warunków analitycznych, a także konfiguracji sprzętu. W przypadku zaobserwowania spadku sprawności parametry analizy mają kluczowe znaczenie dla określenia, czy kolumna w dalszym ciągu nadaje się do użytku. Poniżej wyjaśniono, jak określić sprawność kolumny na podstawie pięciu wskaźników wydajności oraz jak zapobiegać spadkowi wydajności lub korygować go.
Kliknij poniżej, aby przejśćdo tematów:
Ciśnienie wsteczne
Zaleca się monitorowanie ciśnienia wstecznego: Używając nowej kolumny po raz pierwszy, istnieje możliwość zapisania wartości ciśnienia zwrotnego dla danych parametrów analizy jako odniesienia („wspólna zmienna” w MagIC Net). Następnie można użyć wyników zdefiniowanych przez użytkownika, aby monitorować różnicę między początkowym ciśnieniem wstecznym a wyświetlanym podczas bieżących oznaczeń.
Zaobserwowanie wzrostu ciśnienia wstecznego w porównaniu z zapisaną wartością początkową oznacza, że cząstki stałe (zanieczyszczenia) osadziły się w kolumnie ochronnej lub kolumnie separacyjnej. Jeżeli zmierzony wzrost jest większy niż
1 MPa, należy podjąć działania naprawcze. Najpierw należy sprawdzić, której kolumny to dotyczy (ochronnej czy separacyjnej). Jeśli kolumna ochronna jest zanieczyszczona, należy ją wymienić, jest to zupełnie normalne - jej podstawowa funkcja. Jeśli dotyczy to kolumny separacyjnej, wyjmij ją z aparatu, obróć i zainstaluj
w przeciwprądzie, a następnie płucz przez kilka godzin w odwróconym kierunku przepływu, zmniejszając prędkość przepływu do ok. 0,2ml/min. Jeśli to nie pomoże, należy wymienić kolumnę. Będzie to niezbędne, jeśli zostanie osiągnięte maksymalne dopuszczalne ciśnienie wsteczne dla tej kolumny.
Dowiedz się więcej o oprogramowaniu MagIC Net, klikając tutaj
Czas renetcji
Zaleca się obserwację zmian w czasach retencji poszczególnych pików, które sygnalizują spadek wydajności kolumny. Czas retencji ostatniego piku jest monitorowany. Przy standardowych analizach anionów najlepiej nadają się do tego siarczany (SO42-). Tutaj również istnieje możliwość ustawienia wspólnej zmiennej w oprogramowaniu MagIC Net,
aby zapisać początkową wartość.
Niestabilne czasy retencji mogą być spowodowane dwutlenkiem węgla wprowadzanym do eluentu z otaczającego powietrza lub pęcherzykami powietrza obecnymi w eluencie. Problemy te można łatwo rozwiązać (patrz Tabla 1).
Table 1. Zapobieganie i korygowanie utraty wydajności w kolumnach chroamtograficznych IC.
| Wskaźnik | Przyczyna | Środki zapobiegawcze i naprawcze |
|---|---|---|
| Rosnące przeciwciśnienie | Cząsteczki na kolumnie ochronnej | Wymiana kolumny ochronnej |
| Cząsteczki na kolumnie separacyjnej | Wypłukanie kolumny w przeciwnym kierunku
|
|
| Cząsteczki w próbce | Odpowiednie przygotowanie próbki, n.p.usunięcie cząsteczek stosując ultrafiltrację Inline Ultrafiltration. | |
| Skrócony czas retencji | Węglan w eluencie | Dwutlenek węgla z powietrza wplywa na stabilność eluentu składającego z się z węglanu /wodorowęglanu wapnia. Weglanowy/wodorowęglanowy element słabnie w czasie, natomiast element wodorotlenkowych zwiększa swoją moc.
|
| Pęcherzyki powietrza w eluencie | Pęcherzyki powietrza powodują, że przepływ powietrza jest niestabilny. Wachania ciśnienia są wskaźniekiem niestabilnego przepływu, który powinien być stabilny w zakresie ± 0.1 MPa.
|
|
| Utrata pojemności w kolumnie z powodu wysokowartościowych jonów | Zregenerowanie kolumny zgodnie z ulotką kolumny, aby usunąć wszelkie osady niorganiczne. | |
| Utrata rozdzielczości | Za stary eluent lub nieprawidłowo wyprodukowany | Eluenty powinny być świeżo przygotowane. Upewnij się, że są one produkowane prawidłowo, a zwłaszcza, że węglan i wodorowęglan nie są mylone. |
| Efekt adsorpcyjny zanieczyszczenia osadzonego w osłonie |
Wymiana kolumny ochronnej. | |
| Efekt adsorpcyjny zanieczyszczeń osadzających się w kolumnie separacyjnej |
Rregeneracja kolumny zgodnie z ulotką kolumny, aby usunąć wszelkie osady organiczne lub nieorganiczne. | |
| Utrata półek teoretycznych | Zanieczyszczona kolumna ochronna | Wymiana kolumny ochronnej. |
| Zanieczyszczona kolumna separacyjna | Rregeneracja kolumny zgodnie z ulotką kolumny, aby usunąć wszelkie osady organiczne lub nieorganiczne. | |
| Przeładowana kolumna separacyjna | Kolumna rozdzielająca może być przeładowana takimi czynnikami, jak wysoka zawartość soli w matrycy próbki.
|
|
| Martwa objętośćw układzie chromatograficznym |
|
|
| Asymetria | Martwa objętość lub zanieczyszczenie na kolumnie ochronnej | Wymienić kolumnę ochronną. |
| Zanieczyszczona kolumna separacyjna | Rregeneracja kolumny zgodnie z ulotką kolumny, aby usunąć wszelkie osady organiczne lub nieorganiczne. |
Kolumna mogła również stracić trochę pojemności. Ta utrata pojemności może być spowodowana obecnością jonów o wysokiej wartościowości, które są trudne do usunięcia ze względu na ich silne przyciąganie do fazy stacjonarnej. Kolumnę należy następnie zregenerować zgodnie z ulotką kolumny w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń. Jeśli to nie prowadzi do poprawy, rozważ wymianę kolumny w zależności od wymagań aplikacji, szczególnie w przypadku postępującej utraty wydajności.
Utrata pojemności może również wystąpić, gdy grupy funkcyjne są trwale odłączone od fazy stacjonarnej. W takim przypadku kolumny nie można zregenerować i należy ją wymienić.
Rozdzielczość
Zaleca się monitorowanie rozdzielczości pików, porównując pomiary z wcześniej zdefiniowanego wzorca kontrolnego z początkową wartością referencyjną. Jeśli rozdzielczość pomiędzy pikami wynosi R > 1,5, uważa się że są one prawidłowo rozdzielone przez linę bazową (patrz ilustracja poniżej). W przypadku ciężkich, obciążonych matryc i dla pików jonów o dużych stężeniach, wartość rozdzielczości musi być wyższa, aby zapewnić separację tych pików przez linię podstawową.
Jeżeli nastąpi utrata rozdzielczości, najpierw należy się upewnić, że nie jest ona spowodowana przez eluent lub system IC. Jeżeli system IC działa prawidłowo i wykluczymy wpływ eluentu pozostaje możliwość, że jest to efekt adsorpcji zanieczyszczeń na kolumnie ochronnej lub kolumnie separacyjnej. Zanieczyszczoną kolumnę ochronną należy wymienić. Jeśli przyczyną problemu jest kolumna separacyjna należy ją zregenerować zgodnie z instrukcją regeneracji dla danej kolumny w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń zarówno organicznych jak i nieorganicznych. Jeśli utrata rozdzielczości postępuje, wymiana kolumny jest nieunikniona.
Półki teoretyczne
Istnieje możliwość zapisania początkowej liczby półek teoretycznych w oprogramowaniu MagIC Net jako wspólną zmienną, tak jak wcześniej dla innych parametrów. Zwykle używany jest w tym celu ostatni pik – w chromatogramach anionów siarczany ponownie wydają się odpowiednim kandydatem. półki teoretyczne zależą m.in. od stężenia analitu, dlatego idealnie jest monitorować ten parametr podczas analizy roztworów wzorcowych, a nie próbek. Istnieje możliwość kontrolowania zmian liczby półek teoretycznych za pomocą wyników zdefiniowanych przez użytkownika w MagIC Net.
Spadek półek teoretycznych może sugerować powstanie objętości martwej w układzie IC (patrz Tabela 1). Niską liczbę półek teoretycznych można również zaobserwować, jeśli kolumna została przeładowana, na przykład, wysokim stężeniem soli z matrycy próbki. Jeżeli półki teoretyczne zmniejszą się o więcej niż 20%, oznacza to, że wydajność kolumny spada. W zależności od wymagań aplikacji może być konieczne podjęcie działań naprawczych. Należy sprawdzić kolumnę ochronną i jeżeli ona jest przyczyną spadku wydajności, to ją wymienić.
Jeśli problem dotyczy kolumny separacyjnej, należy ją zregenerować zgodnie z instrukcją regeneracji dla danej kolumny w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń zarówno organicznych jak i nieorganicznych. Jeżeli to nie pomoże, należy rozważyć wymianę kolumny, szczególnie w przypadku kiedy proces postępuje.
Asymetria
Tak jak opisano to dla pozostałych parametrów istnieje możliwość monitorowania asymetrii pików. Należy określić początkową asymetrię analitów, mierząc wstępnie zdefiniowany wzorzec kontrolny w warunkach standardowej analizy, następnie zapisać ją jako wspólną zmienną i śledzić wyniki zdefiniowane przez użytkownika. Maksymalne dopuszczalne wartości asymetrii różnią się w zależności od analitu. Na przykład piki wapnia i magnezu już początkowo wykazują stosunkowo wysokie wartości asymetrii.
Asymetria jest definiowana jako odległość od osi piku do opadającej strony piku (B na poniższym rysunku) podzielona przez odległość od osi piku do wznoszącej się strony piku
(A na poniższym rysunku), gdzie obie odległości są mierzone na 10% wysokości piku. Niektóre farmakopee mogą mieć inne kryteria – należy sprawdzić jakie obowiązują w twoim kraju.
AS > 1 oznacza, że pik ma ogon, a AS < 1 oznacza czołowanie piku. Optymalnie jest, gdy asymetria pików jest jak najbliższa wartości 1. Zgodnie z ogólną zasadą, uważa się że wydajność kolumny spada, gdy asymetria wynosi AS > 2 lub AS < 0,5. W zależności od wymagań stosowanej aplikacji należy wtedy podjąć środki w celu poprawy symetrii i umożliwienia lepszej integracji.
Przyczyną wysokich wartości asymetrii może być chromatograf jonowy – na przykład z powodu powstania objętości martwej. Jeśli tak nie jest, konieczne jest sprawdzenie czy problemu nie stanowi kolumna ochronna lub separacyjna. Jeżeli kolumna ochronna jest przyczyną zmiany asymetrii, to trzeba ją wymienić. Jeśli problem dotyczy kolumny separacyjnej, należy ją zregenerować zgodnie z instrukcją regeneracji dla danej kolumny
w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń zarówno organicznych jak i nieorganicznych. Jeżeli to nie pomoże, należy rozważyć wymianę kolumny, szczególnie w przypadku kiedy proces postępuje wtedy jest to nieuniknione.
Podsumowanie
Istnieje wiele sposobów na sprawdzania wydajności kolumny poprzez sprawdzanie wyników konkretnych parametrów przez cały okres jej eksploatacji. Właściwa konserwacja oraz używanie kolumny ochronnej może znacznie wydłużyć żywotność kolumny separacyjnej!
