Stosowanie metod zatwierdzonych przez USP w celu sprawdzenia równoważności kolumn separacyjnych

Farmakopea Stanów Zjednoczonych (USP) rozpoczęła aktualizację około 4300 monografii i 220 rozdziałów ogólnych za pomocą nowoczesnych technologii w 2010 roku [1] W tym czasie chromatografia jonowa (IC) również stała się w miarę dojrzewania coraz popularniejszą techniką analityczną. Agencje regulacyjne uważają obecnie IC za akceptowalną technologię do analizy produktów farmaceutycznych i biofarmaceutycznych.

Zakres analiz chromatograficznych w przemyśle farmaceutycznym jest dość szeroki. Chromatografia jonowa może oceniać śladowe zanieczyszczenia, substancje pomocnicze, aktywne składniki farmaceutyczne (API) i metabolity, a także oznaczać składniki jonowe w roztworach farmaceutycznych i płynach ustrojowych [2–10] Te parametry kontroli jakości można mierzyć w surowcach, podczas procesu produkcyjnego i w produktach końcowych. IC nadaje się również do kontroli jakości wody technologicznej i ścieków – zabezpieczając produkcję i zapewniając, że odprowadzane ścieki spełniają wymogi przepisów [2,11–17]

Ten artykuł na blogu koncentruje się na włączeniu chromatografów jonowych podczas modernizacji metod USP. Omówiono równoważność kolumn separacyjnych oraz sposób, w jaki zwiększa to elastyczność laboratoriów poprzez wdrożenie alternatywnych kolumn do metod analitycznych zgodnie z wymaganiami USP.

Kliknij, aby przejść bezpośrednio do tematu:

Rozdziały ogólne i monografie USP
Przewodnik USP dotyczący walidacji chromatograficznej, kwalifikacji i przydatności systemu
Specyfikacje i wymagania dotyczące wysokiej jakości analiz farmaceutycznych
Kolumna analityczna: istotna część metodologii
Kryteria akceptacji metody USP dla kolumn
Udane badania równoważności kolumn przeprowadzone przez Metrohm
Znaczenie równoważności kolumn w analizie farmaceutycznej

Rozdziały ogólne i monografie USP

USP zapewnia standardy jakości dla bezpiecznych leków, substancji farmaceutycznych, suplementów diety i produktów spożywczych. Podstawowe założenia i definicje podsumowano w rozdziałach „Uwagi ogólne i wymagania”. „Monografie” i „Rozdziały ogólne” opisują procedury testowe i kryteria akceptacji lub ogólne wytyczne mające na celu zapewnienie tożsamości, jakości i czystości produktów.

Przewodnik USP dotyczący walidacji, kwalifikacji i przydatności systemu chromatograficznego

Kapituła Generalna <621> [18] (oraz <1065> [19] i <1225> [20]) koncentruje się na walidacji i kwalifikacji metod chromatograficznych, w tym IC. Określa także wymagania i ramy dla testowania przydatności systemu.

Testy przydatności systemu są integralną częścią procedury analitycznej. Testy te zapewniają odpowiednią wydajność układu chromatograficznego. Zgodność z kryteriami przydatności systemu jest obowiązkowa podczas całej procedury chromatograficznej. Analiza próbki jest dopuszczalna tylko wtedy, gdy wykazano przydatność systemu.

Specyfikacje i wymagania dotyczące wysokiej jakości analiz farmaceutycznych

Ogólny proces walidacji i kwalifikacji metody USP służącej do oznaczania analitów opisany w monografiach i rozdziałach ogólnych jest bardzo złożony i podlega ścisłym wytycznym, jak już wspomniano.

Ogólne procedury chromatograficzne określone w tych metodach USP obejmują wiele szczegółów dotyczących układu i warunków chromatograficznych. W tych warunkach testy przydatności systemu wykazują, że technika chromatograficzna jest solidna i skuteczna w zakresie ilościowego oznaczania analitów będących przedmiotem zainteresowania. Badania takie obejmują powtarzane pomiary próbek i wzorców, które muszą spełniać kryteria akceptacji oraz kryteria wydajności metody [18,21] jak wyjaśniono poniżej:

liczba półek teoretycznych (N, miara wydajności kolumny)
współczynnik ogonowy (zwany także współczynnikiem symetrii A_S, miara asymetrii szczytowej)
rezolucja (R_S, opisuje jakość separacji)
względne odchylenie standardowe – miara powtarzalności układu liczona z kolejnych serii pomiarów dla nie mniej niż trzech, ale maksymalnie sześciu iniekcji lub aplikacji roztworu referencyjnego

Nowoczesne programy do chromatografii jonowej (np. MagIC Net) ułatwiają ogólną procedurę obliczania tych parametrów. Jednakże pełna procedura walidacji jest rygorystyczna, pracochłonna i bardzo złożona.

Kolumna analityczna: istotna część metodologii

Biorąc pod uwagę parametry metodologiczne, oczywiste jest, że kolumna jest kluczową częścią metody. Jest to określone przez wymiary i upakowanie kolumn (lub klasyfikację grupy L zgodnie z bazą danych USP).

Tabela 1 wymienia niektóre grupy L istotne dla analizy IC wraz z ich opisem i równoważnymi przykładami kolumn firmy Metrohm. Można je znaleźć w bazie danych kolumn USP [22] i są również określone w rozdziale dokumentów USP «Odczynniki» [23]

Tabela 1. Opakowania kolumn USP, grupy L, definicje, zgodne kolumny separacyjne firmy Metrohm i monografie USP, jeśli mają one zastosowanie.

	Opis	Zgodna kolumna Metrohm	Monografie USP
L46	Podłoże z polistyrenu/diwinylobenzenu aglomerowane kulkami lateksowymi funkcjonalizowanymi aminą czwartorzędową (średnica 9–11 µm).	Metrosep A Supp 1 - 250/4,6	Worykonazol, roztwór do stosowania miejscowego fluorku sodu i kwaśnego fosforanu, roztwór doustny fluorku sodu, <345> oznaczenie kwasu cytrynowego/cytrynianu i fosforanu
L76	Słaby materiał kationowymienny na bazie krzemionki, średnica 5 µm. Podłoże stanowi polimeryzowany powierzchniowo kwas polibutadienowo-maleinowy zapewniający funkcjonalności kwasu karboksylowego. Pojemność nie mniejsza niż 29 µEq/kolumnę.	Metrosep C 4 - 250/4,0 Metrosep C 6 - 150/4,0	Kapsułki z octanem wapnia, cytrynian potasu i kwas cytrynowy, roztwór doustny, wodorowęglan potasu, tabletki musujące do sporządzania roztworu doustnego, wodorowęglan potasu i sodu oraz kwas cytrynowy, tabletki musujące do sporządzania roztworu doustnego, wodorowęglan potasu i chlorek potasu, tabletki musujące do sporządzania roztworu doustnego (potas)
L91	Mocna żywica anionowymienna składająca się z monodyspersyjnych porowatych perełek polistyrenu/diwinylobenzenu (średnica 3–10 µm) sprzężonych z aminą czwartorzędową.	Metrosep A Supp 10 - 250/4,0 Metrosep A Supp 16 - 100/4,0 Metrosep A Supp 17 - 150/4,0 Metrosep A Supp 19 - 150/4,0	Tlenek cynku, tlenek cynku neutralny, proszek tlenku cynku, roztwór do oczu siarczanu cynku <591>, oznaczanie cynku, fluorek sodu, żel fluorku sodu, roztwór doustny fluorku sodu, tabletki musujące wodorowęglan potasu i chlorek potasu, tabletki musujące do sporządzania roztworu doustnego, tabletki fluorku sodu, cyna Fluor, Monofluorofosforan sodu, Żel z fluorkiem cyny, Mieszanka fosforanów potasu do wstrzykiwań, Tabletki chlorku sodu do sporządzania roztworu, Mieszanka fosforanów sodu do wstrzykiwań
L97	Słaba żywica kationowymienna składająca się z silnie usieciowanego rdzenia z 5,5 µm porowatych cząstek o wielkości porów 2000 Å i składająca się z etylowinylobenzenu usieciowanego 55% diwinylobenzenu. Podłoże jest powierzchniowo szczepione grupami funkcjonalizowanymi kwasem karboksylowym. Pojemność nie mniejsza niż 2400 µEq/kolumnę (4 mm x 25 cm).	Metrosep C Supp 2 - 250/4,0	Wtrysk złożony z wodorowęglanu sodu, Wtrysk złożony z fosforanów sodu
L105	Silna żywica anionowymienna składająca się z wysoce usieciowanych supermakroporowatych cząstek o średnicy 9 µm (2000 Å) funkcjonalizowanych bardzo nisko usieciowanym lateksem (0,2%) w celu zapewnienia miejsc jonów czwartorzędowych alkiloamoniowych.	Metrosep A Supp 4 - 250/4,0	Azotan sodu

Kryteria akceptacji metody USP dla kolumn

Po pierwsze, kolumna musi być przypisana do określonej kategorii L. Materiały dla każdej grupy L lub kategorii mają określone właściwości i fizjochemię kolumny (patrz Tabela 1 dla przykładów). Muszą one odpowiadać właściwościom i chemii kolumny danej kolumny rozdzielającej. Kategorie grupy L mogą obejmować różne kolumny od tego samego dostawcy lub od różnych producentów.

Jeżeli USP przypisuje pojedynczą kolumnę do grupy L, wówczas można zakwalifikować warunki opisane w monografii (np. oznaczenie tlenku cynku zgodnie z USP <591> [24]; AN-U-076) jak opisano wcześniej. Grupa L jest określona dla każdej metody IC —nie konkretna kolumna. Pozwala to użytkownikowi na pewną elastyczność w zależności od jego preferencji przy wyborze kolumny z tej samej grupy L do kwalifikacji metody (Tabela 1).

Równoważność kolumn

Równoważność kolumn umożliwia teraz laboratoriom i producentom kwalifikację kolumn do stosowania zwalidowanych metod chromatograficznych. Rysunek 1 pokazuje ogólną procedurę.

Istnieją dwie możliwości wykonania testowanie równoważności kolumn bez konieczności pełnej walidacji:

użytkownik wybiera kolumnę należącą do ta sama grupa L jak określono dla w pełni zwalidowanej metody
użytkownik wybiera kolumnę należącą do grupy L podobne pod względem właściwości fizykochemicznych fazy stacjonarnej wraz z żadnej zmiany tożsamości podstawnika

Kapituła Generalna USP <621> [18] określa wymagania dla tej procedury wraz z kryteriami przydatności i akceptacji zwalidowanej metody, do której należy zakwalifikować kolumnę.

Rysunek 1. Ilustrowany schemat przedstawiający, w jaki sposób równoważne kolumny separacyjne są proponowane, przeglądane, zatwierdzane i akceptowane przez USP.

Udane badania równoważności kolumn przeprowadzone przez Metrohm

Metrohm zajmuje się przeprowadzaniem pełnych walidacji metod USP. Jeden przykład opisano w Nocie aplikacyjnej AN-S-398: «Fosforany w zastrzykach złożonych z fosforanów sodu i potasu». Tutaj Metrosep A Supp 17 - 150/4,0 Kolumna służy do oznaczania fosforanów.

Kilka kolumn Metrohm (Tabela 1) zostały zakwalifikowane do metod USP w ramach procesu równoważności kolumn. Inne przykłady obejmują walidację Metrosep A Supp 4 - 250/4,0 kolumna do oznaczania azotynów w azotynie sodu (AN-S-400) albo Metrosep A Supp 1 kolumna do oznaczania ilościowego worykonazolu, jak pokazano bardziej szczegółowo poniżej.

Przykład zastosowania: analiza worykonazolu

The Metrosep A Supp 1 kolumna została zakwalifikowana przez USP do analizy związku pokrewnego worykonazolu F. Worykonazol jest lekiem stosowanym w leczeniu ciężkich zakażeń grzybiczych [25] Tabela 2 wymienia wszystkie wymagania USP i parametry metody, a także osiągniętą charakterystykę wydajności dla badania równoważności kolumn.

Badanie przeprowadzono z wykorzystaniem chromatografu jonowego 940 Professional IC Vario w systemie wykorzystującym roztwory związku pokrewnego worykonazolu F RS. Do badania przydatności systemu stosowano różne stężenia (2,5–5 µg/ml) i kompozycje (Tabela 3). Dodatkowo zbadano próbkę roztworu worykonazolu (nr serii: VZFP22009, Tabela 4).

Tabela 2. Wymagania dotyczące równoważności kolumny dla związku F pokrewnego worykonazolu zgodnie z USP.

Związek F powiązany z worykonazolem zgodnie z USP – tabela podsumowująca
Parametry	Monografia USP	Metrohm
Eluent (faza ruchoma)	Roztwór wodorotlenku sodu: 470 g/l wodorotlenku sodu w wodzie Faza ruchoma: metanol, woda i roztwór wodorotlenku sodu (500:1500:0,175)	Taka sama jak monografia USP
Roztwór podstawowy chlorku	86 μg/ml chlorku sodu w wodzie	Taka sama jak monografia USP
Standardowe rozwiązanie magazynowe	250 µg/ml związku pokrewnego USP worykonazolu F RS. Rozpuścić w 50% końcowej objętości metanolem i rozcieńczyć fazą ruchomą do objętości.	Taka sama jak monografia USP
Standardowe rozwiązanie	5,0 μg/ml USP związku pokrewnego worykonazolu F RS ze standardowego roztworu podstawowego w mieszaninie metanolu i fazy ruchomej (50:50)	Taka sama jak monografia USP
Rozwiązanie w zakresie dopasowania systemu A	5 µg/ml USP Voriconazole Associated Compound F RS ze standardowego roztworu podstawowego i 1,7 µg/ml chlorku sodu w mieszaninie metanolu i fazy ruchomej (50:50)	Taka sama jak monografia USP
Rozwiązanie w zakresie dopasowania systemu B	2,5 μg/ml USP związku pokrewnego worykonazolu F RS z roztworu standardowego w fazie ruchomej	Taka sama jak monografia USP
Przykładowe rozwiązanie	5 mg/ml worykonazolu. Rozpuścić w 50% końcowej objętości metanolem i rozcieńczyć fazą ruchomą do objętości.	Taka sama jak monografia USP
Wykrycie	Przewodność z tłumieniem	To samo co monografia USP: Przewodność z tłumieniem (MSM_ChS)
Kolumna	kolumna ochronna 4 mm × 5 cm i kolumna analityczna 4 mm × 25 cm; oba opakowania L46	Metrosep A Supp 1 Guard/4.6 (P/N: 6.1005.340) Metrosep A Supp 1 - 250/4,6 (P/N: 6.1005.300)
Przepływ	1,0 ml/min	Taka sama jak monografia USP
Objętość wtrysku	20 µl	Taka sama jak monografia USP
Czas działania	nie wspomniany	60 minut
Temperatura kolumny	40°C	Taka sama jak monografia USP

System Metrohm IC wykorzystujący Metrosep A Supp 1 - 250/4,6 kolumna spełniła kryteria przydatności USP do analizy związku pokrewnego worykonazolu F RS (Tabela 3).

Tabela 3. Określenie przydatności systemu Metrohm IC w porównaniu z wymaganiami monografii USP do analizy związku F pokrewnego worykonazolu (VRC-F).

Przydatność systemu (n=6)	USP Monografia	Metrohm
Czynnik ogonowy (Rozwiązanie dotyczące dopasowania systemu B)	NMT 2.0 dla piku VRC-F	1.219 (PRZECHODZI)
Względne odchylenie standardowe (Rozwiązanie dotyczące dopasowania systemu B)	NMT 10,0% dla jonu VRC-F	2,347% (PRZECHODZI)
Rozdzielczość pomiędzy jonem VRC-F i jonem chlorkowym (Rozwiązanie dotyczące dopasowania systemu A)	NLT 3,5	11.41 (PRZECHODZI)

Badanie to spełniło również kryterium akceptacji dla analiz próbek worykonazolu (Tabela 4) i został zaakceptowany przez USP. Przykładowy chromatogram związku F pokrewnego worykonazolowi pokazano w Rysunek 2.

Tabela 4. Kryterium akceptacji USP do analizy worykonazolu metodą chromatografii jonowej.

Worykonazol (nr serii: VZFP22009)	Monografia USP	Metrohm
Średnie wyniki próbek: Przygotowanie próbek w trzech powtórzeniach (roztwór próbki worykonazolu)	NMT 0,1%	0,04% (PRZECHODZI)

Rysunek 2. Przykładowy chromatogram wzorca referencyjnego USP dla związku pokrewnego worykonazolu F, oznaczony za pomocą kolumny Metrosep A Supp 1.

Znaczenie równoważności kolumn w analizie farmaceutycznej

Dedykowane laboratoryjne systemy chromatografii jonowej mogą różnić się od konfiguracji zatwierdzonych przez USP. Dzieje się tak głównie ze względu na stosowane kolumny chromatograficzne. Inicjatywa modernizacji monografii USP poszerzyła wybór felietonów o badaczy. Jest to bardzo korzystne dla przemysłu farmaceutycznego.

Badania równoważności kolumn umożliwiają wykorzystanie alternatywnych kolumn analitycznych do wysokiej jakości analiz farmaceutycznych. Oszczędza to znaczną ilość czasu i wysiłku poprzez uniknięcie kilkutygodniowej procedury pełnej walidacji metody. Ostatecznie dokładność i wiarygodność wyników analitycznych są nadal osiągane zgodnie z zwalidowaną metodą.

Metrohm oferuje kilka aplikacji zatwierdzonych przez USP, a także alternatywne kolumny dla zwalidowanych metod USP, zatwierdzonych w wyniku pomyślnych badań równoważności kolumn.

[1] Konwencja Farmakopealna Stanów Zjednoczonych. Monografia Historia modernizacji. https://www.usp.org/get-involved/partner/monograph-modernization-history (dostęp: 13.09.2023).

[2] Kappes, S. Kiedy HPLC zawodzi: IC w analizie żywności, wody i środków farmaceutycznych. Biały papier, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2019.

[3] Kappes, S.; Steinbach, A.; Rut, K. IC: Wszechstronny w analizie farmaceutycznej. Biały papier, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2017.

[4] Metrohm AG. Analiza farmaceutyczna: kontrola jakości produktów farmaceutycznych. Broszura, 8.000.5139EN, Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2015.

[5] Subramanian, N. H.; Wille, A. Przygotowanie próbek na linii produkcyjnej – skuteczne narzędzie do analizy jonów w produktach farmaceutycznych. Metrohm AG, 8.000.6010.

[6] Metrohm AG. Zaktualizuj swoje metody USP! - Korzyści z chromatografii jonowej Metrohm dla analizy API, zanieczyszczeń i substancji pomocniczych. Broszura, 8.000.5436EN, Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2023.

[7] Jenke, D. Zastosowanie chromatografii jonowej w analizie farmaceutycznej i leków. Journal of Chromatographic Science 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[8] Metrohm AG. Kontrola jakości koncentratów dializacyjnych; Nota, AN-D-003; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2022.

[9] Metrohm AG. Jakościowe oznaczanie anionów w moczu w celu sprawdzenia zafałszowania; Nota, AN-S-215; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2005.

[10] Metrohm AG. Mannitol, ramnoza, laktuloza i laktoza w surowicy krwi metodą pulsacyjnej detekcji amperometrycznej (PAD); Nota, AN-P-063; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2016.

[11] Metrohm AG. Standardowe metody analizy wody; Biuletyn Aplikacyjny, AB-221; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2015.

[12] Bruttel, A.; Seifert, N.; Läubli, M.; i in. Monografia: Analiza próbek wody i jej składników za pomocą przyrządów Metrohm, 8.108.5071EN; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2021.

[13] Rut, K. Pomiar kwasów organicznych i anionów nieorganicznych za pomocą chromatografii jonowej i spektrometrii mas. biały papier WP-086EN; Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2023.

[14] Metrohm AG. Monitorowanie śladów w wodzie destylowanej za pomocą chromatografii jonowej; Nota, AN-Q-008; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2015.

[15] Gandhi, J.; Pfundstein, P.; Martin, C.; i in. Monitorowanie środków kontrastowych zawierających jod i gadolin w stacjach uzdatniania wody; plakat techniczny, 8.000.6085EN; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2012.

[16] Pfundstein, P.; Martin, C.; Schulz, W.; i in. Analiza IC–ICP-MS środków kontrastowych MRI na bazie gadolinu (TA-023); LCGC Azja i Pacyfik, 2011.

[17] Metrohm AG. Analiza ścieków w oczyszczalniach. Broszura, 8.000.5142EN, Metrohm AG, Herisau, Szwajcaria 2015.

[18] U. S. Farmakopea/Formuła krajowa. Kapituła Generalna, <621> Chromatografia; USP-NF: Rockville, Maryland, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[19] U. S. Farmakopea/Formuła krajowa. Rozdział Generalny, <1065> Chromatografia jonowa; USP-NF: Rockville, Maryland, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M897_01_01

[20] U. S. Farmakopea/Formuła krajowa. Kapituła Generalna, <1225> Zatwierdzenie Procedur Komendalnych; USP-NF: Rockville, Maryland, USA, 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[21] Schäfer, H.; Läubli, M. Monografia Chromatografia jonowa, 8.108.5077EN; Metrohm AG: Herisau, Szwajcaria, 2023.

[22] U. S. Farmakopea. Kolumny chromatograficzne; USP: Rockville, Maryland, USA, 2023.

[23] U. S. Farmakopea/Formuła krajowa. Odczynniki; USP-NF: Rockville, Maryland, USA, 2023.

[24] U. S. Farmakopea/Formuła krajowa. <591> Oznaczanie cynku. W Kapituła Generalna; USP/NF, Rockville, Maryland, USA; DOI:10.31003/USPNF_M99350_05_01

[25] ASHP. Informacje o lekach dla pacjenta AHFS®: Worykonazol, 2023.