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A segunda parte desta série de blogs sobre melhores práticas para colunas de separação IC concentra-se em tópicos relacionados à aplicação que têm impacto na adequação e estabilidade da coluna. Primeiramente, há a escolha adequada da coluna que melhor se adapta à aplicação pretendida. Em seguida passamos aos parâmetros operacionais que podem ser modificados para otimizar a separação entre os analitos, e quais são os respectivos efeitos e possibilidades.
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Escolha do comprimento e diâmetro da coluna
Metrohm oferece um ampla gama de colunas IC que contêm diferentes fases estacionárias e têm diferentes comprimentos e/ou diâmetros internos. A escolha da fase estacionária tem um grande impacto na seletividade entre os analitos individuais, por um lado, bem como na estabilidade contra diferentes matrizes de amostra, por outro lado. Em vez disso, o comprimento da coluna não tem impacto na seletividade, mas sim na eficiência de separação entre os picos individuais.
Saiba mais sobre a ampla seleção de colunas de separação da Metrohm para cromatografia de íons em nosso Catálogo de colunas.
Efeitos do comprimento da coluna
Nos seguintes cromatogramas (figura 1), o efeito do comprimento da coluna na eficiência de separação para o Série de colunas Metrosep A Supp 17 é mostrado. Ao escolher o comprimento da coluna, você deve levar em consideração a complexidade da separação pretendida e a presença de componentes da matriz que possam perturbar os íons de interesse.
Efeitos do diâmetro da coluna
Além de fornecer diferentes comprimentos de colunas de separação IC, a Metrohm também oferece a maioria das colunas em ambos 4mm diâmetro interno e 2mm versões com diâmetro interno (conhecido como «microbore»). Com relação a isso, existem vários critérios para distinguir:
- Se você usa sistemas on-line em um modo contínuo (ou seja, sistemas que funcionam sem supervisão por vários dias seguidos, como o Metrohm Process Analytics Sistema MARGA – Mmonitor para AeRossóis e Gases em Aar ambiente), recomendamos o uso de colunas IC de 2 mm. Devido à vazão reduzida para colunas microbore (apenas 25% da vazão para colunas de 4 mm), o eluente e as soluções regenerantes duram muito mais tempo, o que aumenta o tempo que o instrumento pode ficar sem supervisão.
- Existem aplicações que requerem técnicas hifenizadas, como IC-MS, para maior seletividade e sensibilidade do analito. Neste caso, o ideal é a utilização de colunas de 2 mm. A baixa vazão é ideal para o processo de eletropulverização e, portanto, nenhum divisor de fluxo é necessário antes de entrar no espectrômetro de massa.
- Às vezes, apenas uma quantidade limitada de amostra está disponível para injeção. Nestas situações, são preferidas colunas de 2 mm. Isto ocorre porque ocorre menos diluição/difusão durante o processo de separação e, portanto, são obtidos sinais mais elevados.
- Por outro lado, se a sua amostra contiver uma carga elevada de componentes da matriz, a seleção de colunas IC de 4 mm adequadas será uma escolha melhor devido à maior capacidade disponível para separar os analitos desejados da matriz.
Saiba mais sobre o MARGA e seus recursos para monitoramento contínuo da qualidade do ar em nossa postagem do blog.
Otimizando a separação do analito
Além da própria coluna, vários outros parâmetros podem ser modificados para otimizar o seletividade da separação. Esses parâmetros incluem temperatura, componentes e resistência do eluente e modificadores orgânicos.
Efeitos da modificação da temperatura
Uma das maneiras mais simples de ajustar a seletividade de separação em IC é modificando a temperatura da análise. Isto é conseguido utilizando o forno de coluna integrado no instrumento (se disponível). Vários efeitos podem ser observados, por exemplo, na análise de ânions. Por exemplo, o impacto da temperatura na seletividade é mostrado na sobreposição do cromatograma (Figura 2) para o Linha de coluna Metrosep A Supp 17.
- Os íons monovalentes como fluoreto, cloreto, nitrito, brometo e nitrato são todos acelerados com o aumento da temperatura, indicando que ocorrem menos interações com a fase estacionária.
- O comportamento de íons multivalentes como fosfato ou sulfato é mais complicado de descrever e varia com cada fase estacionária. Em geral, os íons multivalentes são mais retardados em temperaturas mais altas, o que faz com que os tempos de retenção aumentem, como pode ser visto no sulfato. O fosfato, por outro lado, se comporta de maneira diferente, devido à mudança induzida pela temperatura do pH do eluente em uma faixa próxima ao pKa valor do fosfato. Devido a esta mudança de pH, a carga efetiva do íon fosfato também muda (neste exemplo, a carga efetiva é reduzida com o aumento da temperatura).
- A forma do pico dos íons polarizáveis, como nitrito, brometo e, em particular, nitrato, é significativamente melhorado em temperaturas mais altas. A razão para este comportamento é a redução das interações secundárias com a fase estacionária.
Efeitos da modificação da composição e resistência do eluente
A composição e a concentração do eluente podem ser usadas para alterar a ordem de eluição de vários analitos enquanto se utiliza a mesma coluna de separação. Na cromatografia catiônica, um modelo de retenção foi desenvolvido por PR Haddad e PE Jackson, que permite aos pesquisadores prever os tempos de retenção ao alterar a composição do eluente [1].
Considerando que a coluna permanece idêntica em cada determinação, não é esperada nenhuma alteração no equilíbrio de troca iônica e na capacidade da coluna. Portanto, ao mudar apenas a concentração do eluente, a seguinte correlação pode ser usada:
Onde:
- ok' é o fator de retenção do analito de interesse
- c é uma constante
- x é a carga do analito
- sim é a carga do eluente
- Esim +M é a concentração do eluente na fase móvel
Se o ácido nítrico for usado como eluente, y = 1, e o modelo pode ser simplificado para:
Aplicar esta fórmula a situações práticas de laboratório significa o seguinte: com o aumento da resistência do eluente, os metais alcalino-terrosos são acelerados muito mais rapidamente (x = 2) em comparação com metais alcalinos (x = 1), e assim é possível eluir o magnésio antes do potássio. Este efeito é chamado eletrosseletividade.
Os íons metálicos multivalentes são capazes de formar complexos com agentes complexantes dedicados. Portanto, as seletividades podem ser modificadas pela adição de agentes complexantes ao eluente. Por exemplo, o ácido dipicolínico (DPA) é frequentemente utilizado para complexar o cálcio, o que leva a uma redução da carga efetiva de cálcio. Como consequência, o tempo de retenção do cálcio é reduzido e o cálcio elui antes do magnésio no cromatograma (Figura 3).
A retenção de cátions monovalentes pode ser influenciada pela adição de éter coroa à fase móvel.
Os sistemas aniônicos são mais complexos em relação ao modelo de tempo de retenção, embora o mesmo efeito de eletrosseletividade possa ser observado até certo ponto para os ânions. Contudo, ao alterar a concentração do eluente, o pH do eluente também muda frequentemente, levando a diferentes equilíbrios de desprotonação de ânions multivalentes (por exemplo, fosfato). Isto influencia a carga efectiva do analito e, ao fazê-lo, também influencia a sua retenção de uma forma semelhante à descrita anteriormente para os efeitos da mudança de temperatura.
Em alguns casos, o uso de uma pequena quantidade de um modificador orgânico como metanol, acetonitrila ou acetona no eluente pode fazer sentido:
- Se a contaminação bacteriana já foi um problema antes, a adição de 5% de metanol ao eluente pode ajudar a prevenir o crescimento bacteriano futuro.
- Quando amostras contendo muitos solventes orgânicos precisam ser injetadas e nenhum pré-tratamento da amostra, como extração ou eliminação de matriz (MiPCT-ME) for possível, recomenda-se adicionar um modificador orgânico adequado ao eluente para garantir que o(s) solvente(s) orgânico(s) possa(m) ser adequadamente eliminado(s) da coluna cromatográfica
Preparação de amostras em linha Metrohm (MISP)
- Ao usar IC-MS, também é recomendado adicionar um modificador orgânico ao eluente para melhorar o processo de eletrospray
Esteja ciente de que a adição de modificadores orgânicos também afetará as seletividades de separação. Para os ânions padrão, o efeito é semelhante ao observado com o aumento da temperatura: os formatos dos picos dos íons polarizáveis, como nitrito, brometo e nitrato, são melhorados.
Os ácidos orgânicos, por outro lado, podem reagir de forma muito diferente em comparação com os ânions padrão, e sua reação também depende fortemente do tipo de modificador orgânico utilizado. Cromatogramas de amostra que mostram o efeito do modificador orgânico na retenção de analitos são mostrados no manual do Metrosep A Supp 10 coluna.
Faça o download do Manual da coluna Metrosep A Supp 10 abaixo para ver exemplos de cromatogramas que mostram os efeitos do modificador orgânico no tempo de retenção do analito.
Referência
[1] Haddad, P. R.; Jackson, P. E. Cromatografia Iônica: Princípios e Aplicações; Jornal da biblioteca de cromatografia; Elsevier; Distribuidores para os EUA e Canadá, Elsevier Science Pub. Co: Amsterdã, Holanda; Nova York: Nova York, NY, EUA, 1990.
