Makaleyi paylaş
Kolon performansının izlenmesi ve kolon bakımı
Güvenilir kromatografik analizler sağlamak için temel gereksinimlerden biri yüksek performanslı bir ayırma kolonudur. İyon kromatografi (IC) kullanıcıları, kolonlarının performansını düzenli olarak kontrol etmelidir. Bu şekilde, performansta belirgin bir düşüş meydana gelirse, kolonun yeniden düzgün çalışmasını sağlamak veya bakımını yapabilmek için yeterli süreyi sağlayacak adımlar atılabilir ve numune çıktısındaki aksama süreleri azaltılabilir. Bu blog makalesinde, kolon performansının nasıl değerlendirileceği, hangi parametrelerin izlenmesi gerektiği ve mükemmel kolon performansı sağlamak için hangi önlemlerin alınabileceği açıklanmaktadır.
Metrohm kolonunuzu bulmak için tıklayın
Yeni bir ayırma kolonunun ilk kez kullanılması
Bir kolonu ilk kez kullandığınızda, başlangıç performansını kontrol etmeniz önerilmektedir. Satın alınan her Metrohm kolonu beraberinde alacağınız Analiz Sertifikası (CoA), burada referans kaynağınızdır. Başlangıç performansını kontrol etmek için bir kromatogram kaydederek, CoA'da belirtilen analiz koşullarını kullanabilirsiniz. Bunlar arasında akış hızı, sıcaklık, eluent (mobil faz), analit konsantrasyonu, örnek enjeksiyon hacmi ve baskılama (supressör) yer almaktadır.
Sonuç parametrelerinin bazılarını CoA'da listelenen değerlerle (ör. tutunma zamanı, teorik plaka sayısı, asimetri faktörü, çözünürlük ve pik yüksekliği) karşılaştırarak kolon performansını değerlendirebilirsiniz.
Kolon performansının düzenli olarak izlenmesi
Halihazırda kullanımda olan kolonlar da düzenli olarak izlenmelidir. Kolon performansı analiz türüne, ilgili analiz koşullarına ve enstrümantal düzene bağlı olarak değişebildiği için bu testlerin, normalde kullandığınız uygulama koşulları altında kontrol standartları ile gerçekleştirilmesi önerilmektedir. Performansta bir azalma gözlemlenirse uygulamanın gereksinimleri, uygulamanın hala kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek açısından çok önemlidir.
Aşağıda beş performans göstergesine göre kolon performansını nasıl belirleyebileceğiniz açıklanmaktadır. Ayrıca, performanstaki düşüşü nasıl önleyebileceğinizi veya düzeltebileceğinizi de öğrenebilirsiniz.
İhtiyacınız olan konu içeriğine doğrudan gitmek için aşağıda yer alan bağlantıları kullanın:
Geri basınç
Geri basıncı takip edin: Yeni kolonunuzu ilk kez kullandığınızda, uygulamanızın analiz koşulları altındaki geri basınç değerini referans olarak kaydedin (MagIC Net yazılımında «ortak değişken» özelliği). Daha sonra, başlangıçtaki geri basınç ile mevcut analiz sırasında görüntülenen geri basınç arasındaki farkı izlemek için yazılımda yer alan kullanıcı tanımlı sonuçlar özelliğini kullanabilirsiniz.
Kaydedilen başlangıç değeriyle karşılaştırıldığında, geri basınçta bir artış tespit edilirse bu, parçacıkların ön-kolonda veya ayırma kolonunda biriktiğini göstermektedir. Ölçülen artış değeri 1 MPa'dan büyükse, önlem alınmalıdır. Öncelikle hangi kolonların (ön kolon ve/veya ayırma kolonu) etkilendiği kontrol edilmelidir. Ön kolon kontamine olmuş ise, birincil işlev olarak değiştirilmelidir. Ayırma kolonu etkilenmiş ise, sistemden sökülür, ters çevirilir ve yeniden takılır, ardından bu ters akış yönünde birkaç saat boyunca yıkanır. Eğer bu işe yaramazsa, kolonu değiştirmeyi düşünmeniz önemle tavsiye edilmektedir. Kolon için izin verilen maksimum geri basınca ulaşıldığında bu gerekli olacaktır.
MagIC Net yazılımı hakkında daha fazla bilgi edinmek için tıklayın
Tutunma zamanı
Tutunma zamanındaki değişiklikleri (kolon performansındaki bir düşüşe işaret eder) izlemek için son analit pikinin tutunma zamanı kromatogramda takip edilmektedir. Örneğin sülfat bunun için uygundur, çünkü genellikle standart anyon kromatogramlarının hemen sonunda ayrışmaktadır. Burada da, başlangıç değerini kaydetmek için MagIC Net'te yer alan ortak değişken özelliği ile çalışılabilir.
Kararsız tutunma zamanları, ortam havasından gelen karbondioksitten veya eluentte bulunan hava kabarcıklarından kaynaklanabilir. Neyse ki bu sorunlar kolayca çözülebilmektedir (bkz. Tablo 1).
Tablo 1. IC kolonlarındaki performans kayıplarının önlenmesi ve düzeltilmesi.
| Gösterge | Sebep | Koruyucu ve düzeltici önlemler |
|---|---|---|
| Karşı basıncın artması | Ön kolonda parçacıklar | Ön kolonu değiştirin. |
| Ayırma kolonunda parçacıklar | Ayırma kolonunu ters akış yönünde yıkayın:
|
|
| Numunedeki parçacıklar | Numune hazırlama, örneğin; Inline Ultrafiltrasyon yoluyla parçacıkları uzaklaştırın | |
| Daha kısa tutunma zamanı | Eluentteki karbonat | Havadaki karbondioksit, eluentteki karbonat/hidrojen karbonat dengesini etkiler. Bir karbonat/hidrojen karbonat eluenti zamanla zayıflarken; bir hidroksit eluent kuvvetlenir.
|
| Eluentteki hava kabarcıkları | Hava kabarcıkları eluent akışını kararsız hale getirir. Karşı basınç dengesiz akışın bir göstergesidir. Basınç ± 0,1 MPa aralığında stabil kalmalıdır.
|
|
| Yüksek valanslı iyonlardan kaynaklı kolonda kapasite kaybı | İnorganik birikintileri gidermek için kolonu broşürüne göre rejenere edin. | |
| Çözünürlük kaybı | Eluent çok eski veya yanlış hazırlanmış | Eluentler taze olarak hazırlanmalıdır. Doğru üretildiklerinden ve özellikle karbonat ile hidrojen karbonatın birbirine karıştırılmadığından emin olun. |
| Ön kolonda biriken kirliliğin adsorptif etkisi | Ön kolonu değiştirin. | |
| Ayırma kolonunda biriken kirliliğin adsorptif etkisi | Organik veya inorganik birikintileri gidermek için kolonu broşürüne göre rejenere edin. | |
| Teorik plaka sayısının azalması | Ön kolon kontaminasyonu | Ön kolonu değiştirin. |
| Ayırma kolonu kontaminasyonu | Organik veya inorganik birikintileri gidermek için kolonu broşürüne göre rejenere edin. | |
| Ayırma kolonunun aşırı yüklenmesi | Ayırma kolonu, numune matrisindeki yüksek tuz içeriği gibi faktörler nedeniyle aşırı yüklenebilir.
|
|
| IC sistemindeki ölü hacim |
|
|
| Asimetri faktörü | Ön kolonda ölü hacim veya kontaminasyon | Ön kolonu değiştirin. |
| Ayırma kolonunda kontaminasyon | Organik veya inorganik birikintileri gidermek için kolonu broşürüne göre rejenere edin. |
Kolon ayrıca bir miktar kapasite kaybetmiş olabilir. Kapasite kaybına, sabit faza güçlü çekimleri nedeniyle uzaklaştırılması zor olan yüksek valanslı iyonların varlığı neden olabilmektedir. Bu durum sonrasında kolon, herhangi bir kontaminasyonu ortadan kaldırmak için kolon broşürüne uygun olarak rejenere edilmelidir. Yapılan işlem herhangi bir iyileşmeye yol açmazsa, özellikle ilerleyen kapasite kaybı durumunda, uygulamanın gereksinimlerine bağlı olarak kolonu değiştirmeyi düşünebilirsiniz.
Fonksiyonel grupların sabit fazdan kalıcı olarak ayrılması durumunda da kapasite kaybı meydana gelebilir. Böyle bir durumda, kolonun rejenere edilmesi mümkün değildir ve değiştirilmesi gerekmektedir.
Çözünürlük
Önceden tanımlanmış bir kontrol standardından alınan ölçümleri bir başlangıç referans değeriyle karşılaştırarak kromatografik çözünürlüğü izleyebilisiniz. Çözünürlük R > 1,5 ise sinyalin taban çizgisinden ayrılmış olduğu kabul edilmektedir (aşağıdaki görsele bakınız). Bununla birlikte, yüksek derecede konsantre matrisler içeren durumlarda ve daha geniş bir alana yayılan pikler için temel ayrımı sağlamak amacıyla çözünürlük değerinin daha yüksek olması gerekmektedir.
Çözünürlük kaybı meydana gelirse, öncelikle bunun eluent veya IC sisteminden kaynaklanmadığından emin olunmalıdır. Bunlar bir kez göz ardı edildiğinde, ön kolon veya ayırma kolonundaki kontaminasyonların adsorptif etkisinin sorumlu olması mümkündür. Kontamine olmuş bir ön kolon değiştirilmelidir. Sorunun nedeninin ayırma kolonu olduğu tespit edilirse, kolonun her türlü organik veya inorganik kontaminasyondan arındırılması için kolon broşürüne uygun bir şekilde rejenere edilmesi gerekecektir. Çözünürlük kaybının ilerlemesi durumunda ise kolon değişimi kaçınılmazdır.
Teorik plaka sayısı
Daha önce diğer parametreler için belirtildiği gibi, MagIC Net'teki teorik plakaların başlangıç sayısını ortak bir değişken olarak kaydedebilirsiniz. Genellikle son elüsyon piki kullanılır; anyon kromatogramlarında sülfatın uygun bir aday olduğu bir kez daha kanıtlanmıştır. Teorik plaka sayısı aynı zamanda analit konsantrasyonuna da bağlıdır. Bu nedenle, bu parametrenin numune ölçümleri sırasında değil, kontrol standardı ölçümleri sırasında izlenmesi idealdir. MagIC Net'teki kullanıcı tanımlı sonuçlar aracılığıyla teorik plaka sayısındaki herhangi bir değişikliğin gelişimini takip edebilirsiniz.
Teorik plaka sayısındaki bir azalma, IC sistemindeki ölü hacmin göstergesi olabilmektedir (Tablo 1). Örneğin kolon, numune matrisindeki yüksek tuz konsantrasyonu nedeniyle aşırı yüklenmişse, teorik plaka sayısının azlığı da gözlemlenebilir. Teorik plaka sayısının %20'den fazla azalması, kolon performansının düştüğünü göstermektedir. Uygulamanın gerekliliklerine bağlı olarak, aksiyon alınması gerekebilir.
Performanstaki düşüşün nedeni ön kolon ise değiştirilmelidir. Sorun ayırma kolonundaysa, organik veya inorganik kontaminasyonu ortadan kaldırmak için kolonun, kolon broşürüne uygun bir şekilde rejenere edilmesi önerilmektedir. Bu işe yaramazsa ve özellikle daha düşük teorik plaka sayısına doğru bir eğilim gözlemleniyorsa, kolonu değiştirmeyi düşünmelisiniz.
Asimetri faktörü
Uygulamanızın analiz koşulları altında, önceden tanımlanmış bir kontrol standardını ölçerek analitlerin başlangıç asimetrisini belirleyebilirsiniz. Bunu ortak bir değişken olarak kaydedebilir ve ardından asimetri faktörünün zaman içindeki gelişimini gözlemlemek için kullanıcı tanımlı sonuçları takip edebilirsiniz. Asimetri faktörü için kabul edilebilir maksimum değer analite bağlı olarak değişmektedir. Örneğin, kalsiyum ve magnezyum pikleri başlangıçta nispeten yüksek asimetri değerleri sunar.
Asimetri faktörü, pikin merkez çizgisinden pikin iniş ayağına kadar olan mesafenin (aşağıdaki şekilde B), pikin merkez çizgisinden pikin çıkış ayağına kadar olan mesafeye (aşağıdaki şekilde A) bölünmesiyle tanımlanmakta ve burada her iki mesafe de pik yüksekliğinin pik tabanından %10'luk kısmında ölçülmektedir. Bazı farmakopelerde başka değerler kullanılabilir; lütfen ülkenizdeki gerekliliklerden emin olmak için kontrol ediniz.
AS >1, bir pikin kuyruğu olduğu anlamına gelir ve AS <1, pikin ön kısmına eşittir. En ideal kromatografi, pik asimetrilerinin mümkün olduğu kadar 1'e yakın olmasıyla elde edilmektedir. Genel bir kural olarak, asimetri AS >2 veya AS <0,5 olduğunda kolon performansının düştüğü kabul edilir. Uygulamanın gereksinimlerine bağlı olarak bu durumda simetriyi geliştirmek ve daha iyi integrasyon sağlamak için önlemler alınması gerekir.
Yüksek asimetri değerlerinin nedeni, iyon kromatografiye bağlı (ör. ölü hacim) olabilmektedir. Durum böyle değilse, asimetrinin ön kolondan mı yoksa ayırma kolonundan mı kaynaklandığının bulunması önemlidir. Ön kolon asimetriye neden oluyorsa değiştirilmelidir. Sorun ayırma kolonu ise, her türlü organik veya inorganik kirliliğin giderilmesi için öncelikle kolon, kolon broşürüne uygun bir şekilde rejenere edilmelidir. Bu işe yaramazsa kolonu değiştirmeyi düşünmelisiniz. Daha yüksek asimetri değerlerine doğru bir eğilim gözlemlenir ise kolon değişimi kaçınılmazdır.
Özet
Kolonun performansını tahmin etmenin ve kullanım ömrü boyunca somut rakamları izlemenin birçok yolu vardır. Ekstra koruma için her zaman bir ön kolonun kullanılmasının yanı sıra doğru bakım, ayırma kolonunun ömrünü uzatabilmektedir. Daha fazla bilgi için bu konuyla ilgili diğer blog makalelerimize göz atın!
