Cromatografía iónica para la industria farmacéutica

La Cromatografía Iónica (IC) es una técnica analítica utilizada para separar y cuantificar analitos iónicos y polares. La IC ha sido ampliamente aceptada por la industria farmacéutica y los organismos reguladores para una gama ampliada de aplicaciones como la calidad del agua y el análisis químico. Se ha capacitado en los últimos años para analizar productos farmacéuticos. El Formulario Nacional de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP-NF, Farmacopea de los Estados Unidos (USP)), el organismo de normalización líder para productos (bio)farmacéuticos, incrementó el potencial de la IC durante sus enfoques de modernización, estableciéndola como una técnica apropiada y válida en sus Capítulos Generales compendiales, ensayos y pruebas de impurezas.

Este artículo presenta brevemente los principios de la Cromatografía Iónica y luego analiza las aplicaciones y los beneficios de su uso para el análisis farmacéutico sobre la base del Capítulo General de la USP <1065> Cromatografía iónica.

¿Qué es la Cromatografía Iónica?
¿Por qué es importante la Cromatografía Iónica para la industria farmacéutica?
Técnicas de detección de IC y sus aplicaciones según USP <1065>

¿Qué es la Cromatografía Iónica?

La cromatografía iónica es un tipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) que se utiliza para separar y cuantificar analitos iónicos y polares simultáneamente, utilizando con mayor frecuencia el intercambio iónico como mecanismo de separación [1–3] (Animación 1).

Animación 1. Principio de la cromatografía de intercambio iónico. Los iones se unen a la superficie con carga opuesta de las partículas de la columna y se eluyen de la superficie cuando fluye el eluyente iónico. La separación de analitos depende de la relación carga-tamaño, por ejemplo, las especies monovalentes se eluirán más rápido que las especies divalentes o multivalentes. En la cromatografía iónica, el eluyente y los analitos tienen propiedades químicas similares. Cuanto mayor sea la concentración del eluyente, más cortos serán los tiempos de retención de los analitos.

La combinación de columnas de separación por intercambio iónico y detección de conductividad representa la mayoría de las aplicaciones de CI, pero también es común el uso de otras técnicas de detección como UV/VIS, detección amperométrica o hibridación con espectrómetros de masas [3,4]. Los componentes principales de una configuración de cromatografía líquida se muestran en Figura 1Estos incluyen una bomba de alta presión con almacenamiento de fase móvil (eluyente), inyector (introducción de muestra), columna de separación (columna analítica) y el sistema de detección (incluyendo derivatización, adquisición de datos y procesamiento de datos).

Figure 1. Esquema de una configuración de cromatografía líquida modificada del Capítulo General <1065> de la USP [3].

Obtenga más información sobre el desarrollo de la cromatografía iónica en Metrohm y sus numerosas técnicas de detección con estos materiales relacionados.

Blog: Historia de Metrohm IC – Parte 1

Monografía: Cromatografía iónica

Monografía: Cromatografía iónica práctica: una introducción

¿Por qué es importante la cromatografía iónica para la industria farmacéutica?

Si bien los métodos HPLC dominan los métodos de cromatografía líquida en la industria farmacéutica, la IC también ha sido ampliamente aceptada. Las ventajas de la IC sobre otros métodos cromatográficos líquidos o tradicionales como la titulación para la industria farmacéutica se pueden resumir de la siguiente manera: [5,6]:

Análisis de múltiples analitos en una sola ejecución
Dedicado a analitos iónicos y polares
Camino de flujo libre de metales
Los eluyentes se basan en sales, ácidos débiles o bases débiles.
Supresión (Animación 2) para una línea base baja y una relación señal-ruido baja, mejorando la sensibilidad analítica
Instrumentación flexible: varios detectores (por ejemplo, conductividad, UV/VIS, detección amperométrica o combinación con espectrómetros de masas), un alto grado de automatización para máxima eficiencia y bajo costo de propiedad (por ejemplo, Opciones de preparación de muestras en línea o calibración con un solo estándar)

Animación 2. IC – la solución definitiva para sus desafíos analíticos.

La IC como método validado para los estándares USP-NF

Como uno de los organismos impulsores de la estandarización de los métodos farmacéuticos, la USP-NF garantiza la calidad, seguridad y eficacia de los productos farmacéuticos dentro del proceso de fabricación y su uso [6,7]. La historia de las normas USP-NF es bastante larga: más de 200 años [6]. Sin embargo, nuevos criterios de calidad y tecnologías respaldaron una iniciativa de modernización global de la FDA (EE. UU.) Administración de Alimentos y Medicamentos) y USP-NF en 2010.

IC, como enfoque metodológico para el análisis de trazas de impurezas, excipientes, ingredientes farmacéuticos activos (API), metabolitos y productos de degradación y componentes iónicos en soluciones farmacéuticas y fluidos corporales [5,8–15], se convirtió en un enfoque validado en numerosos capítulos de la USP, ensayos, pruebas de impurezas e identificación. Aquí, la CI reemplazó parcialmente los métodos tradicionales (por ejemplo, la titulación) o se incluyó en nuevos estándares centrados en el uso de métodos de última generación.

Los fundamentos de las técnicas cromatográficas se dan en los Capítulos Generales de la USP <621> y <1065> [16,17]. Estos capítulos generales describen detalles sobre la metodología y la configuración general, así como los parámetros y requisitos clave para la precisión y confiabilidad de los métodos cromatográficos en el análisis farmacéutico.

Capítulos generales de la USP <621> y <1065>: Principios básicos y fundamentos de la cromatografía

El Capítulo General de la USP <621> brinda una descripción general de varias técnicas cromatográficas junto con definiciones de los aparatos y procedimientos (por ejemplo, fase móvil, columna, tipos de elución, procedimiento del método), parámetros comunes y requisitos para las pruebas de idoneidad del sistema (por ejemplo, repetibilidad del sistema, sensibilidad del sistema y rendimiento máximo) [16]. La clasificación de las columnas cromatográficas también se explica con una lista de rellenos (números L), fases (G) y soportes (S), que funcionan como referencias para los cromatógrafos [18].

En el siguiente artículo se explican los números L para los enfoques de cromatografía iónica USP y se brinda información sobre el procedimiento de equivalencia de columnas.

Entrada de blog: Aplicación de métodos validados por la USP para la equivalencia de columnas de separación

Por otra parte, el Capítulo General de la USP <1065> proporciona una descripción general completa del IC [16,17] y su importancia como procedimiento de prueba reconocido para identificar y cuantificar analitos específicos (ensayos e impurezas). La cromatografía iónica es un procedimiento de caracterización válido en muchas circunstancias y se alinea con todos los aspectos de la producción farmacéutica [8,17]. Su campo de aplicación es amplio e incluye el control de calidad de materias primas, sustancias farmacológicas o productos formulados, así como la evaluación de aguas de proceso utilizadas para la fabricación, medios de cultivo, soluciones de limpieza o corrientes de aguas residuales [17]. La USP <1065> comprende conocimientos básicos de esta técnica: qué es la cromatografía iónica, detalles de la instrumentación (Figura 1), mecanismos de detección comunes, procedimientos y notas importantes para el desarrollo de métodos apropiados.

Explicaciones más extensas de los criterios y requisitos para la validación de métodos están vinculadas al Capítulo General <1225> Validación de Procedimientos Compendiales. Esto incluye pruebas de idoneidad del sistema para garantizar que el sistema de IC funcione correctamente antes del análisis mediante la evaluación de parámetros que incluyen resolución, tiempo de retención y forma del pico, así como requisitos para la validación con parámetros clave como linealidad, precisión, exactitud, especificidad, límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ) [19]. En general, al desarrollar un método de CI, es muy importante seleccionar fases móviles y estacionarias apropiadas (Figura 1) para garantizar una separación eficiente y una selectividad y sensibilidad adecuadas (requisitos según USP <1225>) [17,19]. Las fases móviles generalmente consisten en ácidos, bases o sales diluidos disueltos en agua de alta pureza, mientras que las fases estacionarias pueden ser materiales a base de sílice o de polímeros.

Debido a su importancia, las columnas y fases móviles apropiadas se incluyen en las monografías y capítulos generales de la USP. Sin embargo, la equivalencia de columnas brinda a los usuarios cierta libertad para implementar el método en el flujo de trabajo analítico.

Obtenga más información sobre las columnas IC en nuestra serie de publicaciones de blog, que comienza aquí.

Blog: Prácticas recomendadas para columnas de separación en cromatografía iónica (IC): Parte 1

Técnicas de detección de IC y sus aplicaciones según USP <1065>

En esta sección se analizan cuatro métodos de detección de IC comúnmente utilizados (Haga clic a continuación para saltar a un tema):

Detección de conductividad
Detección UV/VIS
Detección amperométrica
IC vinculado a espectrometría de masas

Detección de conductividad

El método de detección de IC más común es la conductividad [17]. El principio, basado en la conductividad, se muestra en Animación 3 [2]. La detección de conductividad mide qué tan bien los iones en una solución conducen la corriente eléctrica entre dos electrodos, proporcionando información sobre la concentración de especies iónicas presentes. Cuando se combina con un supresor, la señal de fondo se reduce y la sensibilidad y la relación señal-ruido mejoran significativamente (Animación 2) [2,17].

Animación 3. En este vídeo se muestra el principio de detección de conductividad para cromatografía iónica.

El IC con detección de conductividad tiene una amplia gama de aplicaciones para el análisis farmacéutico, que incluyen:

Solicitud	Analito	Matriz	Nota de aplicación de Metrohm
Aniones	fluoruro	sal de fluoruro de sodio	AN-S-375
		fluoruro de sodio pasta de dientes en gel	AN-S-376
		tabletas de fluoruro de sodio	AN-S-379
		monofluorofosfato de sodio (Na₂FOP₃)	AN-S-380
		solución tópica para el cuidado dental con fluoruro de sodio	AN-S-399
	cloruro	comprimidos efervescentes de bicarbonato de potasio y cloruro de potasio para suspensión oral	AN-S-373
	fosfato	inyecciones compuestas de fosfato de sodio y potasio	AN-S-398
Cationes	calcio y magnesio	tabletas de carbonato de calcio y magnesio; tabletas masticables de carbonato de calcio y magnesia	AN-C-194
	sodio	inyecciones compuestas de bicarbonato de sodio y fosfato de sodio	AN-CS-021
	potasio	tartrato de potasio ácido (bitartrato de potasio)	AN-C-181
Moléculas complejas	N-metilpirrolidona (NMP)	clorhidrato de cefepima	AN-C-111

La particularidad de la IC radica en la determinación de múltiples analitos en una sola ejecución, como se muestra, por ejemplo, para múltiples analitos aniónicos (acetato, cloruro, citrato y sulfato en una solución de infusión; AN-N-051) o para componentes catiónicos (sodio, potasio, calcio y magnesio en fórmulas de alimentación por goteo; AN-C-022). Gracias a las columnas de IC de alta capacidad, la separación de analitos es posible incluso en las matrices más resistentes [7].

Detección UV/VIS

UV/VIS: una técnica de detección óptica que se puede utilizar directamente, indirectamente, o con derivatización post-columna – es útil para detectar iones que absorben luz UV/VIS [2,17].

Detección directa UV-VIS Se utiliza junto con la detección de conductividad, por ejemplo, para la determinación de iones que absorben fuertemente en el rango UV (nitrito, nitrato, aniones orgánicos) para mejorar su detectabilidad en presencia de altas concentraciones de iones inorgánicos (cloruro, fosfato, sulfato) que no tienen o tienen poca capacidad de absorción UV [2]. El principio de este método de detección se muestra en Animación 4.

Animación 4. En este vídeo se muestra el principio de detección UV/VIS para cromatografía iónica.

Cromatograma para la determinación de nitrito con detección UV/VIS en una muestra de hidroxipropilmetilcelulosa. La separación se realizó en una columna Metrosep A Supp 10. Para mejorar la sensibilidad, se utilizó la técnica de preconcentración inteligente de Metrohm con eliminación de matriz (MiPCT-ME).

Figure 2. Cromatograma para la determinación de nitrito con detección UV/VIS en una muestra de hidroxipropilmetilcelulosa. La separación se realizó en una columna Metrosep A Supp 10. Para mejorar la sensibilidad, se utilizó la técnica de preconcentración inteligente de Metrohm con eliminación de matriz (MiPCT-ME).

El ejemplo en Figura 2 (AN-S-402) muestra la determinación de nitrito en hidroxipropilmetilcelulosa según USP <621>. El análisis de nitrito es de gran importancia durante la producción farmacéutica para prevenir la formación de nitrosaminas cancerígenas. Incluso si el nitrito se puede detectar de manera confiable con conductividad (por ejemplo, en sales de nitrito de sodio, AN-S-400), la detección directa UV/VIS a 215 nm es el método preferido para el análisis a nivel de trazas.

Para detección indirecta de rayos ultravioletaSe utilizan eluyentes con alta absorbancia en la región espectral visible o ultravioleta (por ejemplo, tampones de ftalato) [17]. La longitud de onda de detección se selecciona de tal manera que el eluyente absorba, pero los iones de la muestra no. Esta elección da como resultado picos negativos que son proporcionales a la concentración del analito.

Determinación de zinc en una muestra de óxido de zinc según el Capítulo General <591> de la Farmacopea de los Estados Unidos utilizando un 930 Compact IC Flex con detección UV/VIS (947 Professional UV/VIS Detector Vario). Se utilizó un relleno de fase estacionaria L91 (Metrosep A Supp 10) con una fase móvil PDCA, cumpliendo con todos los requisitos de la USP. Las muestras se introdujeron automáticamente con un centro de muestras 889 IC, genial.

Figure 3. Determinación de zinc en una muestra de óxido de zinc según el Capítulo General <591> de la Farmacopea de los Estados Unidos utilizando un 930 Compact IC Flex con detección UV/VIS (947 Professional UV/VIS Detector Vario). Se utilizó un relleno de fase estacionaria L91 (Metrosep A Supp 10) con una fase móvil PDCA, cumpliendo con todos los requisitos de la USP. Las muestras se introdujeron automáticamente con un centro de muestras 889 IC, genial.

Durante Detección UV/VIS después de la reacción post-columnaLos analitos se detectan después de que el efluente de la columna se combina con un reactivo, formando un compuesto que absorbe la luz en longitudes de onda UV o visibles. La detección UV-VIS con derivatización post-columna se utiliza principalmente para detectar metales de transición como hierro, níquel, cobre, manganeso o zinc (AN-U-076, Figura 3).

Detección amperométrica

La detección amperométrica es un método analítico electroquímico en el que se mide la corriente generada por la oxidación o reducción de analitos en un electrodo de trabajo en función del tiempo [20] (Animación 5).

Animación 5. En este vídeo se muestra el principio de detección amperométrica.

Un requisito previo es que los iones objetivo deben poder reducirse u oxidarse, es decir, ser sustancias electroactivas [2,17]. Los ejemplos de analitos son compuestos orgánicos, metales de transición, aniones (por ejemplo, nitrito, nitrato, sulfuro, sulfito) o carbohidratos [2]. Algunos ejemplos del uso de CI con detección amperométrica para la industria farmacéutica incluyen la lactosa (en productos lácteos y suplementos, AN-P-089), catecolaminas (en una solución inyectable farmacéutica, AN-P-053), gentamicina (en solución de gentamicina, AN-P-080) y propilenglicol (en solución tópica de diclofenaco, AN-P-076).

Nuestro Libro blanco describe la determinación de fosfato de polirribosilribitol (PRP) en un Haemophilus influenzae Vacuna que utiliza IC con detección amperométrica pulsada (Figura 4).

Figure 4. Determinación del contenido de fosfato de polirribosilribitol (PRP) en una muestra de vacuna mediante CI. La separación se realizó en una columna de intercambio aniónico utilizando un eluyente de acetato de sodio-hidróxido de sodio seguido de una detección amperométrica pulsada utilizando un electrodo de trabajo de oro y un electrodo de referencia Ag/AgCl.

La línea negra en el cromatograma muestra un estándar con una concentración de 3 µg/mL de PRP. La línea azul-verde indica el contenido total de PRP (concentración final 19,42 mg/L), dentro del 80–120% del valor indicado en la etiqueta (16–24 mg/L). Según los criterios de calidad, se requiere que el PRP libre sea menos del 20% del contenido total de PRP. La muestra (línea verde lima en el cromatograma) muestra el contenido de PRP libre determinado (concentración final de 2,03 mg/L) y se ajusta a los requisitos.

IC combinada con espectroscopia de masas

La cromatografía iónica se puede combinar con los espectrómetros de masas para mejorar la sensibilidad de detección de ácidos orgánicos, carbohidratos o oligoelementos. La instrumentación inerte garantiza flexibilidad en cuanto a la fase móvil utilizada y protege contra la contaminación, lo que es especialmente importante para la especiación de oligoelementos. La técnica de supresión de CI garantiza que el líquido que ingresa a estos espectrómetros de masas altamente sensibles solo contenga analitos y agua (y quizás algunos modificadores orgánicos). Esto es beneficioso para las condiciones de funcionamiento estables, la sensibilidad del análisis y la extensión de la vida útil del instrumento.

Obtenga más información sobre la separación de sílabas de IC con MS con nuestros recursos aquí.

Combinación entre la cromatografía iónica y la espectrometría de masas

White paper: Introducción a la cromatografía iónica y espectrometría de masas (IC-MS)

Conclusión

La cromatografía iónica es una herramienta analítica potente y versátil para aplicaciones farmacéuticas. Es capaz de manejar una amplia variedad de tipos de muestras y proporciona una alta sensibilidad al detectar sustancias iónicas e ionizables. La capacidad del IC para combinar diferentes estrategias de detección lo hace invaluable en la fabricación de productos farmacéuticos y para el control de calidad.

[1] Weiss, J.; Shpigun, O. Manual de cromatografía iónica, 4ª ed.; Wiley-VCH: Hoboken, Nueva Jersey, EE. UU., 2016; Vol. 3.

[2] Schäfer, H.; Läubli, M. Monografía Cromatografía iónica; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2023.

[3] Kolb, M.; Seubert, A.; Schäfer, H.; Laubli, M. (Editor). Monografía: Cromatografía iónica práctica, 3ª ed.; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2020.

[4] Seubert, A.; Frenzel, W.; Schäfer, H.; et al. Monografía: Técnicas de detección avanzadas en cromatografía iónica; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2016.

[5] Cappella, S. Cuando la HPLC falla: IC en análisis de alimentos, agua y productos farmacéuticos. Libro blanco, WP-045EN, Metrohm AG, Herisau, Suiza 2019, 11.

[6]Klein, M. Iniciativa de modernización de monografías de la USP que conduce a métodos modernos basados en cromatografía iónica. Informe técnico, WP-092EN–2023-11, Metrohm AG, Herisau, Suiza 2023, 8.

[7]Suss, E. Avances en el análisis farmacéutico con cromatografía iónica. Columna 2024, 20 (8), 9–16.

[8] Kappes, S.; Steinbach, A.; Ruth, K. IC: El todoterreno en análisis farmacéutico. Libro blanco, WP-019EN, Metrohm AG, Herisau, Suiza 2017, 6.

[9] Metrohm AG. Análisis Farmacéutico: Control de Calidad de Productos Farmacéuticos. Folleto, 8.000.5139ES – 2015-09, Metrohm AG, Herisau, Suiza 2015, 40.

[10] Subramanian, N. A.; Wille, A. Preparación de muestras en línea: una herramienta eficaz para el análisis de iones en productos farmacéuticos. Metrohm AG, 8.000.6010.

[11] Metrohm AG. ¡Actualice sus métodos USP! - Los beneficios de la cromatografía iónica de Metrohm para sus análisis de API, impurezas y excipientes. Folleto, 8.000.5436ES – 2023-05, Metrohm AG, Herisau, Suiza 2023, 3.

[12]García, J. Aplicación de la cromatografía iónica en el análisis de fármacos y productos farmacéuticos. Revista de ciencia cromatográfica 2001, 49 (7), 524–539. DOI:10.1093/chrsci/49.7.524

[13] Metrohm AG. Control de calidad de concentrados de diálisis: análisis integral de aniones, acetato y cationes mediante CI; Nota de Aplicación, AN-D-003-2022-08; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2022.

[14] Metrohm AG. Determinación cualitativa de aniones en orina para verificar adulteración; Nota de Aplicación, AN-S-215, 2005; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2005.

[15] Metrohm AG. Manitol, ramnosa, lactulosa y lactosa en suero sanguíneo con detección amperométrica pulsada (PAD); Nota de Aplicación, AN-P-063, 2016; Metrohm AG: Herisau, Suiza, 2016.

[16] tú. S. Farmacopea/Formulario Nacional. Capítulo General, <621> Cromatografía; USP-NF: Rockville, MD, EE. UU., 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99380_07_01

[17] tú. S. Farmacopea/Formulario Nacional. Capítulo general, <1065> Cromatografía iónica; USP-NF: Rockville, MD, EE. UU., 2023. Documento de la investigación: 10.31003/USPNF_M897_01_01

[18] tú. S. Farmacopea. Columnas cromatográficas; USP: Rockville, MD, EE. UU., 2023.

[19] tú. S. Farmacopea/Formulario Nacional. Capítulo General, <1225> Validación de los procedimientos compendiales; USP-NF: Rockville, MD, EE. UU., 2023. DOI:10.31003/USPNF_M99945_04_01

[20] D. Roldán, R. Detección en cromatografía iónica. Revista de cromatografía A 1991, 546, 175–187. DOI:10.1016/S0021-9673(01)93016-X

Más información

Monografías de medicamentos, ensayos y evaluaciones de impurezas: actualice sus métodos USP con la cromatografía iónica de Metrohm

Flyer: ¡Actualice sus métodos USP!

Blog: Aplicación de métodos validados por la USP para la equivalencia de columnas de separación

White paper: Cuando falla la HPLC: IC en análisis de alimentos, agua y productos farmacéuticos

Seminario web a pedido: De los principios activos a las impurezas y excipientes: cromatografía iónica para el análisis farmacéutico

Webinar: Cromatografía iónica para aplicaciones farmacéuticas

Webinar: Análisis de impurezas en productos farmacéuticos mediante cromatografía iónica

Iniciativa de modernización de monografías de la USP que conduce a métodos modernos basados en cromatografía iónica

Este informe técnico gratuito ofrece una descripción general de la iniciativa de modernización de la USP y por qué la cromatografía iónica ha sido adoptada por la USP a gran escala. Además, explica qué es la cromatografía iónica y cómo supera las limitaciones encontradas con la HPLC.

Autora

Dr. Elke Süss

Application Specialist Ion Chromatography
Metrohm International Headquarters, Herisau, Switzerland